引起手足口病的柯萨奇病毒A组10型在中国的流行及基因特征

发布时间：2017-09-07 04:46

  本文关键词：引起手足口病的柯萨奇病毒A组10型在中国的流行及基因特征

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【摘要】：研究背景：手足口病(Hand, foot, and mouth disease, HFMD)是一种儿童常见的传染病,其致病原可以有由多种人肠道病毒引起,以5岁以下的婴幼儿为主。近年来,HFMD发病率显著升高,并呈现出季节性流行和全年散发的趋势。多种肠道病毒均可引起HFMD,其中以EV-A71及CV-A16型最为常见。除此之外,柯萨奇病毒A10型(Coxsackievirus A10, CV-A10)等其他柯萨奇A组病毒在手足口病病原谱中也逐渐呈上升趋势。目前的研究表明CV-A10常可导致一些轻症的疾病,如手足口病、疱疹性咽峡炎等,但是国内外也有病毒性脑膜炎、死亡等重症病例的报道。尽管目前CV-A10在手足口病病原谱中占一定的比例,但目前对其在HFMD中的病原构成、我国地域的分布和基因变异变迁规律的研究报道较少。本研究针对我国2004-2012年从HFMD分离到的CV-A10的VP1基因变异变迁进行了系统的分析和研究,并对我国本土流行基因型的3D区的基因特征进行了重组分析。研究目的：本研究通过对国内2009-2012年9省市57份导致手足口病的CV-A10的VP1区基因变异变迁规律及3D区的基因重组的分析,获得国内CV-A10的分子流行病学特征,为手足口病的病原学诊断、CV-A10相关的HDMD的防控工作提供了重要的病毒学基础资料。研究方法：参照肠道病毒病毒分离鉴定标准方法,对HFMD临床标本中实时定量荧光RT-PCR (rRT-PCR)检测结果为非EV71和非CA16的其他肠道病毒进行病毒分离,提取阳性分离株的RNA,进行VP1编码区5’端或3’端的的RT-PCR扩增和PCR产物的核苷酸序列测定,获得序列经sequencher 5.0和BLAST分析,鉴定肠道病毒血清型别。筛选鉴定为CV-A10的毒株,用自行设计的VP1区、3D区特异性引物扩增VP1编码区和3D区,PCR产物经基因序列测定。VP1区序列与Genebank中检索到的其他的CV-A10的毒株的VP1区进行核苷酸同源性分析。挑选基因型B和基因型D各1株代表株,将其3D区基因序列与所有A组原型株序列及Blast后亲缘关系最近的序列的3D区比较。研究结果：本研究从2009-2012年HFMD病例中共分离CV-A10病毒57株,并获得的57条VP1全长基因序列。从GenBank下载1950-2012所有VP1序列175条,依据VPl全长构建亲缘性进化树。依据VP1基因国际上现将CV-A10划分为A、B、C和D四个基因型,本研究的57株中的56株CV-A10与国内大部分CV-A10均属于基因型C,只有1株属于基因型B。1.C基因型的中国CV-A10来源于2008-2012年分离株,其核苷酸同源性为93.93%-100%,氨基酸同源性为96.84%-100%；这5年病毒株存在明显年代与基因变异变迁的进化关系,2011-2012毒株组成cluster 1,多聚集于tree的顶端；而2008-2010(cluster 2)多位于树的末端,两者核苷酸差异为3.6%～6.2%；2. B基因型的中国CA10来源于2004-2009年分离株,包括2009年湖南的1株、2004-2008年山东的5株和2009年深圳2株,其核苷酸同源性为90.6～97.5%,氨基酸同源性为97.8%-100%；其与其他基因型的核苷酸差异为15.48%-21.9%,氨基酸差异为4.7%-9.3%；3.依据3D区序列,提示CV-A10已发生明显重组,且不同的基因型存在两个不同的重组方式。本研究C基因型代表株CQ12-6与CV-A5原型株亲缘关系最近,核苷酸同源性为81.7%；本研究中国2009年分离的B基因型代表株HUN09-22与2009年分离于台湾的CV-A6 (GenBank号为JQ946050)亲缘关系最近,其核苷酸同源性为94.3%,同时与CV-A4、CV-A14及CV-A16原型株位于同一个进化分枝上,其核苷酸同源性分别为83.6%、83.0%和84.1%；4.通过对中国疾病预防信息系统HFMD病原构成分析,提示四川省2011-2013年非EV-A71非CV-A16其他肠道病毒在实验室检测病例所占比例逐渐上升,分别为15%、33%、48%。本研究证实在2013年其他肠道病毒的病原构成中CV-A6占51%,CV-A10占10%。结论：1.我国CV-A10本土流行株有两个基因型C和B,这2个基因型在3D区存在不同的重组进化方式。C基因型VP1区存在明显年代与基因变异变迁的动态进化关系；2.最近三年CV-A6、CV-A10等导致HFMD的其他肠道病毒有增多趋势。3.本研结果为CV-A10相关的HFMD的诊断、防控工作提供了重要的病毒学基础资料。
【关键词】：手足口病 CV-A10 流行 基因特征
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R725.1
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 缩略语12-14
• 1. 引言14-22
• 1.1. 手足口病14-17
• 1.1.1. 病原学14-15
• 1.1.2. 流行病学15
• 1.1.3. 临床表现15
• 1.1.4. 流行概况15-16
• 1.1.5. 治疗与预防16-17
• 1.2. 肠道病毒17-20
• 1.2.1. 肠道病毒发现历史17-18
• 1.2.2. 肠道病毒分子结构18-19
• 1.2.3. 肠道病毒的分型19-20
• 1.2.4. 肠道病毒与疾病20
• 1.3. 柯萨奇A组10型20-22
• 1.3.1. CV-A10的流行历史20-21
• 1.3.2. CV-A10与疾病21
• 1.3.3. CV-A10分子特征研究概述21
• 1.3.4. 手足口病病原谱构成变化21-22
• 2. 材料和方法22-40
• 2.1. 材料22-26
• 2.1.1. 毒株来源22
• 2.1.2. 毒株筛选22
• 2.1.3. 主要试剂22-25
• 2.1.4. 主要耗材25
• 2.1.5. 主要仪器25-26
• 2.2. 采集标本的种类、保存和运输26-27
• 2.2.1. 粪便标本26-27
• 2.2.2. 咽拭子标本27
• 2.2.3. 肛拭子标本27
• 2.2.4. 注意事项27
• 2.3. 标本的处理27-28
• 2.3.1. 粪便标本和肛拭子的处理27-28
• 2.3.2. 咽拭子标本的处理28
• 2.4. 病毒分离28-32
• 2.4.1. 细胞培养28-30
• 2.4.2. 接种和观察(病毒分离)30-32
• 2.5. 肠道病毒分型鉴定32-36
• 2.5.1. 临床标本病毒RNA提取32
• 2.5.2. 病毒培养物RNA提取32
• 2.5.3. 引物来源32-33
• 2.5.4. PCR扩增33-34
• 2.5.5. PCR产物的鉴定34
• 2.5.6. PCR产物纯化回收34-35
• 2.5.7. 标记反应35
• 2.5.8. 记反应产物纯化35-36
• 2.5.9. 序列测定36
• 2.6. 序列整理和其他相关分析软件36
• 2.7. CV-A10 VP1区、3D特异性扩增引物36-37
• 2.8. CV-A10 VP1区全长、3D区序列获得37-38
• 2.8.1. RT-PCR扩增CV-A10 VP1区全长及3D区37-38
• 2.8.2. CV-A10PCR产物的鉴定38
• 2.8.3. 产物纯化回收38
• 2.8.4. 标记反应38
• 2.8.5. 标记反应产物纯化38
• 2.8.6. 序列测定38
• 2.8.7. 序列整理38
• 2.9. 序列比对及同源性分析38-39
• 2.10. 中国CV-A10毒株3D区重组分析39
• 2.11. CV-A10在手足口病病原谱中的构成39-40
• 3. 结果40-53
• 3.1. 毒株信息40
• 3.2. CV-A10的VP1区特异性引物扩增结果40-41
• 3.3. 测序结果41-42
• 3.4. 同源性分析42-45
• 3.5. 国内CV-A10同源性分析45-49
• 3.6. 中国CV-A10毒株3D区重组分析49-52
• 3.7. CV-A10在手足口病病原谱中的构成52-53
• 4. 讨论53-58
• 4.1. CV-A10流行现状53-54
• 4.2. CV-A10流行病学特征54
• 4.3. CV-A10遗传进化关系54-55
• 4.4. CV-A10基因分型55-56
• 4.5. CV-A10基于3D区的基因重组分析56
• 4.6. CV-A10在手足口病病原谱中的构成56-57
• 4.7. 手足口病诊断和防控工作挑战57-58
• 5. 小结58-59
• 参考文献59-62
• 综述 手足口病的流行病学恃征与研究进展62-72
• 参考文献69-72
• 致谢72-74
• 硕士期间发表文章74

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