RXRA在法洛四联症发病中的作用机制初步研究

发布时间：2017-09-14 01:50

  本文关键词：RXRA在法洛四联症发病中的作用机制初步研究

  更多相关文章： 圆锥动脉干畸形 法洛四联症 RXRA Cx43单核酸多态性 甲基化 启动子 基因表达

【摘要】：心脏圆锥动脉干畸形是一类导致紫绀和低氧血症的复杂先天性心脏病,包括法洛四联症(TOF)、肺动脉闭锁、大动脉转位、右室双出口、永存动脉干等多种表型。圆锥动脉干畸形的共同病因被认为是流出道的发育障碍。法洛四联症是最主要的圆锥动脉干畸形,主要表现为右室流出道部分的发育异常、主动脉骑跨,室间隔缺损和右室肥厚,是造成我国婴儿和新生儿死亡最主要的原因之一,因此研究其发病机制,对于开展产前筛查、预防和干预具有重要意义。 类视黄酸受体alpha(RXRA)是视黄酸(RA)信号通路中的重要受体,RA信号通路已被证实在心脏发育的多个环节包括流出道的发育发挥重要作用,提示RXRA在心脏发育过程中的重要作用。此外,RXRA基因敲除小鼠(Rxr α-/-)可出现圆锥动脉干畸形表现。据此推测,RXRA可能是TOF的候选致病基因。但目前并未见先天性心脏病患者中RXRA的相关研究,缺乏有力的人群研究证据。 作为哺乳动物心脏中最主要的间隙连接蛋白,动物实验已显示Connexin43(Cx43)可能是圆锥动脉干畸形遗传易感性的候选基因。本课题组前期在中国法洛四联症患者人群中对Cx43基因进行验证,发现法洛四联症患者中Cx43存在异常高表达。其异常分布和高表达可能影响了心脏发育过程中神经嵴细胞迁移以及一些重要信号通路和转录因子的信号传导,导致右室流出道梗阻等表型异常。但是法洛四联症患者中Cx43异常高表达的原因尚不明确。 本研究通过检测法洛四联症患儿的RXRA基因编码区和启动子序列、右室流出道心肌组织中RXRA蛋白和mRNA的表达水平及其表达调控机制,探讨人类法洛四联症与候选易感基因RXRA的关系,并且通过初步探讨RXRA蛋白和Cx43蛋白在法洛四联症发病机制中存在的蛋白作用分子机制,阐明RXRA基因究竟在哪些环节上参与法洛四联症发病机制。 第一部分法洛四联症患儿RXRA基因编码区及启动子区序列分析 目的： 对中国TOF患儿中RXRA基因编码区及启动子区序列进行分析,探讨RXRA基因变异与TOF的关系。 方法： 收集TOF患儿外周血213例及年龄和性别与病例组尽量匹配的健康儿童外周血500例,提取基因组DNA, PCR扩增转录RXRA编码区序列、外显子内含子连接处及启动子区序列,进行测序。对RXRA基因序列变化与TOF的关系进行分析。 结果： 1.外显子2及外显子3各发现一个未报道的SNP:C.237G/A和c.288A/G。c.237G/A和c.288A/G位点碱基改变未导致氨基酸改变,且基因型频率和等位基因频率在两组间差异无统计学意义； 2.在TOF组RXRA基因外显子内含子连接处共发现两个杂合突变,分别为第四外显子上游5bp处的c.431-5C/T和第八外显子下游1lbp处c.1135+11C/G。上诉两个突变在两百例正常儿童中未检测到。 3.在TOF组RXRA基因转录起始点(TSS)上游1191bp处检测出一个杂合突变,即-1191A/G (TSS定为+1)。该突变在五百例正常儿童中未检测到。在TSS上游1287bp处检测出一个杂合突变,即-1287C/T。该突变在五百例正常儿童中检测到一例。此外,共检测出两个新发SNP,即-800C/A及-760C/T。上诉两个SNP基因型频率和等位基因频率在两组间差异无统计学意义；通过生物信息学预测这四个位点及其附近有多个转录因子结合位点。 小结： 1.TOF患儿RXRA基因编码区突变少见。 2.TOF患儿RXRA基因启动子区序列变化可能通过影响转录因子结合而影响RXRA表达水平从而导致TOF的发生。 第二部分法洛四联症患儿右室流出道心肌组织RXRA基因的表达研究 目的： 检测TOF患儿右室流出道心肌组织中RXRA基因mRNA和蛋白水平表达情况,探讨其表达异常在TOF发病中的作用。 方法： 选取30例TOF患儿右室流出道心肌组织作为研究对象,以10例非心源性死亡右室流出道心肌组织为对照,分别应用Real-time PCR和免疫组化检测TOF患者和对照组心肌组织中RXRA基因mRNA及蛋白表达水平。 结果： 1. Real-time PCR提示TOF病例组心肌组织中RXRA基因mRNA水平较正常对照组减低。 2.免疫组化结果提示TOF病例组心肌组织中RXRA蛋白水平同样较正常对照组减低。 小结： TOF患儿可能存在转录和翻译水平调控异常,导致RXRA mRNA和蛋白水平表达均降低。 第三部分法洛四联症患儿右室流出道心肌组织中RXRA基因表达调控机制的研究 目的： 检测TOF患儿右室流出道心肌组织中RXRA基因启动子区甲基化水平,从转录调控机制探讨TOF患儿RXRA基因表达降低的原因及其参与TOF发病的环节。 方法： 选取26例TOF患儿右室流出道心肌组织作为研究对象,以6例与之年龄和性别相匹配的非心源性死亡儿童右室流出道心肌组织为对照,应用BSP技术检测TOF患儿右室流出道心肌组织中RXRA基因启动子甲基化水平,同时应用Luciferase报告基因验证有差异的甲基化位点的功能。 结果： 1.TOF患儿RXRA启动子区-1000至-1453区域整体甲基化水平较对照组增高。 2.生物信息学网站预测RXRA启动子区-1000至-1453区域具有多个转录因子包括Spl结合位点。 3.双荧光素酶实验结果提示RXRA启动子区-1000至-1453区域具有增强转录水平的作用。对PGL3-RXRA-promoter报告基因载体进行体外甲基化后再转染,结果提示其转录水平较未甲基化者降低。 小结： RXRA启动子区-1000至-1453区域包含多个转录调节元件,具有增强转录水平的作用。TOF患者该区域DNA甲基化水平增高可能通过抑制转录因子的结合,导致转录水平降低。 第四部分法洛四联症患者中RXRA蛋白和Cx43蛋白的相关机制研究 目的： 初步探讨RXRA蛋白和Cx43蛋白在法洛四联症发病机制中存在的蛋白作用分子机制。 方法： 构建人类RXRA蛋白和Cx43蛋白表达载体,体外共转染HEK293T细胞,利用western blot和免疫荧光技术检测RXRA蛋白和Cx43蛋白表达变化情况,同时利用Real-time PCR检测RXRA及Cx43mRNA表达变化情况；利用9-cis RA处理HEK293T细胞,增加其内源性RXRA的表达,同时利用western blot检测Cx43蛋白表达变化情况；构建RXRA mRNA表达干扰质粒,内源性降低RXRA的表达,同时检测Cx43蛋白表达变化情况。 结果： 1.体外共转染RXRA蛋白和Cx43蛋白表达载体,western blot和免疫荧光均提示RXRA蛋白会抑制Cx43蛋白表达,而Real-time PCR提示RXRA蛋白对Cx43蛋白表达的抑制是发生在转录水平 2.9-cis RA处理HEK293T细胞后,Cx43蛋白表达较未处理者降低； 3.利用干扰质粒抑制RXRA的表达后,检测结果示Cx43蛋白表达增加。 小结： RXRA可能抑制Cx43mRNA及蛋白的表达,TOF患者中RXRA表达水平降低,可能使其对Cx43的表达抑制作用减弱,导致Cx43异常高表达。
【关键词】：圆锥动脉干畸形 法洛四联症 RXRA Cx43单核酸多态性 甲基化 启动子 基因表达
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R725.4
【目录】：

• 目录3-4
• 缩略词4-5
• 中文摘要5-9
• 英文摘要9-13
• 引言13-15
• 第一部分 法洛四联症患儿RXRA基因编码区和启动子区DNA序列分析15-33
• 前言15
• 资料和方法15-23
• 结果23-31
• 第一部分讨论31-32
• 第一部分小结32-33
• 第二部分 法洛四联症患儿右室流出道心肌组织RXRA基因的表达研究33-42
• 前言33
• 资料与方法33-38
• 实验结果38-41
• 第二部分讨论41
• 第二部分小结41-42
• 第三部分 法洛四联症患儿右室流出道心肌组织RXRA基因表达调控研究42-61
• 前言42
• 资料和方法42-54
• 实验结果54-59
• 第三部分讨论59-60
• 第三部分小结60-61
• 第四部分 法洛四联症患儿中RXRA蛋白和Cx43蛋白的相关机制研究61-74
• 前言61
• 资料和方法61-67
• 实验结果67-72
• 第四部分讨论72-73
• 第四部分小结73-74
• 全文总结及创新性、局限性、展望74-75
• 参考文献75-80
• 综述80-91
• 参考文献85-91
• 致谢91-92
• 研究生期间文章发表及奖励92-93
• 参加学术会议93-94

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

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本文编号：847173