新生儿乙型肝炎病毒宫内感染传播途径的分子机制研究

发布时间：2017-09-15 21:38

  本文关键词：新生儿乙型肝炎病毒宫内感染传播途径的分子机制研究

  更多相关文章： 乙型肝炎病毒 母婴传播 外周血单个核细胞 原位聚合酶链反应 滚环扩增

【摘要】：目的:了解HBs A阳性孕妇其新生儿发生HBV宫内感染的危险因素,为预防和控制新生儿HBV宫内感染提供参考。探讨乙型肝炎病毒感染外周血单个核细胞的情况,并利用原位PCR技术检测PBMC中HBV的表达情况,研究PBMC在发生HBV宫内感染中的作用。内容与方法:1.新生儿HBV宫内感染危险因素分析(1)研究对象连续收集2008年8月至2012年9月北京地区各级医院产前检查的HBs Ag阳性孕妇及其新生儿共312对作为队列,收集研究对象的临床流行病学数据并采集血液标本。(2)研究方法1)流行病学调查:采用巢式病例对照研究的方法,使用统一定制的调查表,对研究对象进行详细询问并记录,同时将临床检查结果一并填写进调查表中。2)血清学检测:采用酶联免疫吸附试验(ELISA)双抗夹心法,对研究对象的血液标本中的HBs Ag和HBe Ag进行检测;选取HBV S基因启动子和终止子附近的保守序列设计引物,检测血清和PBMC中的HBV DNA。3)统计分析方法:先将资料进行核查,然后录入Epi Data 3.1,建立数据库,然后用SPSS 22.0软件对数据进行处理与分析;计量资料的结果使用±S表示,分析方法使用t-text检验分析;计数资料的结果使用率或构成比表示,比较时使用t-text或者χ2检验;使用Excel2013和Graph Pad Prism5.0软件对图表进行处理。2.PBMC转染实验以及细胞原位PCR技术检测PBMC中HBV DNA和ccc DNA(1)PBMC转染实验通过PCR扩增得到HBV DNA基因组全长片段,通过连接构建入T载体,转入感受态细胞后,经涂板蓝白斑筛选阳性后扩大培养,使用含去除内毒素的质粒提取试剂盒提取质粒后,利用扩增时加入的酶切位点,酶切产物,得到高浓度HBV DNA全基因组质粒。分离健康人PBMC后,经过电转染方式将HBV DNA转染进入健康人PBMC中,通过培养后检测PBMC中HBV的表达。(2)细胞原位PCR技术检测PBMC中的HBV DNA和ccc DNA将获得的HBV感染者的血浆,经过Ficoll密度梯度离心法分离得到PBMC,通过细胞甩片机将PBMC离心固定至粘附载玻片上,利用原位PCR技术检测PBMC中的HBV DNA;使用滚环扩增加跨缺口原位PCR技术检测PBMC中的ccc DNA,在显微镜下观察其HBV DNA和ccc DNA在细胞中的分布和位置。结果1.HBV母婴传播的危险因素分析(1)HBs Ag阳性孕妇其婴儿血液标本的实验室检测结果分析对312例HBs Ag阳性孕妇及其新生儿的实验室检测结果表明,共142例孕妇其新生儿发生了HBV宫内感染,宫内感染率为45.5%(142/312)。142例宫内感染的新生儿中,血清HBs Ag阳性24例(7.7%,24/312),血清HBV DNA阳性61例,(19.6%,61/312),外周血单个核细胞中HBV DNA阳性81例,(26.0%,81/312)。其中有15例(4.8%,15/312)新生儿同时检测出血清HBs Ag阳性和HBV DNA阳性,9例(2.9%,9/312)新生儿全部检测结果均阳性。(2)HBs Ag阳性母亲发生新生儿HBV宫内感染的危险因素分析综合312例HBs Ag阳性母亲及其新生儿的临床流行病学数据、人口学调查数据及实验室检测结果进行分析,结果显示:170例(54.5%170/312)新生儿未发生宫内感染,142例(45.5%,142/312)新生儿发生宫内感染;母亲PBMC HBV DNA阳性100例(32.1%,100/312),其中67例发生宫内感染,33例未发生宫内感染,经卡方检验χ2=27.40,p0.001;母亲HBe Ag检测阳性人数78例(25%,78/312)其中54例发生宫内感染,24例未发生宫内感染,经卡方检验χ2=20.82,p0.001;母亲血清HBV DNA阳性137例(43.9%,137/312),其中73例发生宫内感染,64例未发生宫内感染,经卡方检验χ2=5.95,p=0.0147;表明母亲PBMC HBV DNA、血清HBV DNA和HBe Ag阳性是发生新生儿HBV宫内感染的危险因素,其它因素如分娩年龄、分娩方式、新生儿体重等均与HBV宫内感染无关。进一步分析母亲血清中HBV DNA含量与新生儿HBV宫内感染的关系发现,血清中HBV DNA的含量越高,发生宫内感染的概率越大。血清HBVDNA含量高于106copies/ml的孕妇对比血清HBVDNA含量低于103copies/ml的孕妇,其新生儿发生宫内感染的相对危险度为5.33(95%CI为2.78~10.2);血清HBV DNA在103copies/ml至106copies/ml之间的孕妇相对危险度为2.61(95%CI为1.07~6.38),经趋势卡方检验三组宫内感染率差异有统计学意义,χ2值为28.24,p0.001。2.HBV DNA电转染PBMC实验利用PCR成功提取出HBV DNA全基因组序列,经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物条带与预期结果一致;连接转化后将提取的目的基因连接产物双酶切,其产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定;使用紫外分光光度计测得目的基因质粒浓度为20ng/ml;质粒通过电转染的方式转染健康人PBMC,培养6小时和24小时后的提取细胞DNA,利用荧光定量PCR方法检测细胞中HBV DNA的拷贝数,分别为5.67×103copies/ml和7.4×104copies/ml。3.发生宫内感染新生儿PBMC细胞原位检测分析利用原位PCR技术检测乙型肝炎患者PBMC细胞中HBV DNA的表达情况,以乙型肝炎患者肝组织石蜡切片为阳性对照,以核固红染色为背景颜色,肝组织和PBMC的细胞核中可以观察到蓝紫色团块;通过滚环扩增加跨缺口原位PCR技术对ccc DNA进行检测,在肝组织和细胞的细胞核中发现有蓝紫色团块。在对孕妇PBMC中ccc DNA原位检测的过程中发现,原位检测的阳性率与血清HBV DNA含量有相关性,通过对比74例样本发现,外周血HBV DNA含量高,PBMC中检测ccc DNA的阳性率越高。25例外周血HBV DNA含量高于106copies/ml的患者中HBV ccc DNA阳性43例(89.6%,43/48),26例外周血HBV DNA含量低于106copies/ml的患者中HBV ccc DNA阳性12例(46.2%,12/26),经卡方检验χ2=16.7,p0.001;在针对62例母婴对的婴儿PBMC原位检测结果汇总发现,25例发生宫内感染的婴儿,其中22例PBMC中ccc DNA检测阳性,阳性率88%(22/25),fisher精确卡方计算结果显示p0.001。结论本研究发现,HBs Ag阳性孕妇的血清HBe Ag、血清HBV DNA和PBMC HBV DNA阳性为生新生儿宫内感染的高危因素,对婴儿PBMC中HBV DNA的检测有助于判断宫内感染的发生;通过转染乙型肝炎病毒至健康人外周血单个核细胞,通过荧光定量PCR和细胞原位PCR技术检测证实PBMC可以感染HBV。利用滚环扩增加跨缺口原位PCR技术检测新生儿PBMC中ccc DNA证实宫内感染的发生与PBMC有关,被HBV感染的PBMC在发生新生儿HBV宫内感染的过程中发挥重要作用。
【关键词】：乙型肝炎病毒 母婴传播 外周血单个核细胞 原位聚合酶链反应 滚环扩增
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R722.13
【目录】：

• 缩略词表4-5
• 中文摘要5-9
• Abstract9-13
• 前言13-16
• 第一部分 新生儿乙型肝炎病毒宫内感染危险因素分析16-27
• 1. 概述16-17
• 2. 材料与方法17-22
• 3. 结果22-25
• 4. 讨论25-26
• 5. 结论26-27
• 第二部分 外周血单个核细胞在HBV母婴传播中的作用研究27-56
• 第一节 外周血单个核细胞转染HBV DNA27-40
• 1. 概述27-28
• 2. 材料、仪器与方法28-36
• 3. 结果36-38
• 4. 讨论38-39
• 5. 结论39-40
• 第二节 原位聚合酶链反应检测外周血单个核细胞中HBV DNA和ccc DNA40-56
• 1. 概述40-41
• 2. 材料、仪器与方法41-50
• 3. 结果50-54
• 4. 讨论54-55
• 5. 结论55-56
• 讨论56-59
• 结论59-60
• 参考文献60-66
• 作者简介66-67
• 致谢67

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 杨红英,张学宁,白中华,刘晓莉,毛选珍,沈秀芬,周增娣;四种病原体宫内感染的综合性诊断方法研究[J];中华检验医学杂志;2002年03期

2 徐雯;胡颖;;HBV宫内感染机制及基因的影响[J];胃肠病学和肝病学杂志;2007年04期

3 施凯舜;施维群;;191例孕产妇HBV宫内感染危险因素Logistic回归分析[J];吉林医学;2012年24期

4 贾青青,顾扬;乙型肝炎免疫球蛋白阻断HBV宫内感染的疗效及其适应症研究[J];新生儿科杂志;2001年05期

5 张宏岩;育龄妇女宫内感染检测1390例分析[J];临床医学;2001年09期

6 谢爱兰;宫内感染发生早产的机理[J];国外医学.妇幼保健分册;2003年04期

7 敖黎明,钱继红,陈冠仪,张蓉,刘兰女,陈孝瑾,吴圣楣;单纯疱疹病毒Ⅱ型宫内感染的前瞻性研究[J];上海医学;2004年09期

8 麦风和;乙型肝炎病毒宫内感染的研究现状[J];中国全科医学;2004年16期

9 王慧燕,陈素华;孕早期巨细胞病毒活动性感染患者可溶性白细胞介素2受体水平与病毒宫内感染的关系[J];中华围产医学杂志;2005年03期

10 魏俊妮,王素萍,冯丽萍,双杰玉;母-儿细胞转运在HBV宫内感染机制中的作用[J];卫生研究;2005年04期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 施凯舜;施维群;;191例孕产妇HBV宫内感染危险因素Logistic回归分析[A];第二十一次全国中西医结合肝病学术会议论文汇编[C];2012年

2 施凯舜;施维群;;191例孕产妇HBV宫内感染危险因素Logistic回归分析[A];2011年长江三角洲中医肝病协作组学术会议暨浙江省中医药学会肝病分会学术年会文集[C];2011年

3 林巧;刘晋洪;吴其恺;高洁;陈家建;万学信;聂广;杨大国;;干扰素γ基因+874位点及肿瘤坏死因子α基因-238位点单核苷酸多态性与HBV宫内感染相关性研究[A];全国第3届中西医结合传染病学术会议暨中国中西医结合学会传染病专业委员会第2届委员会议论文汇编[C];2010年

4 单若冰;;宫内感染[A];第五届环渤海围产医学学术会议暨山东省第四次围产医学学术会议论文汇编[C];2012年

5 葛艳玲;朱启昒;王建设;;白细胞介素-12B基因+1188位点基因多态性与HBV宫内感染易感性的研究[A];中华医学会第十四次全国儿科学术会议论文汇编[C];2006年

6 张磊;谭雅慧;于晓寒;徐锐;闫永平;徐德忠;;西安地区乙肝孕产妇宫内感染的流行病学研究[A];中华医学会第十六次全国病毒性肝炎及肝病学术会议论文汇编[C];2013年

7 葛艳玲;朱启昒;王建设;;白细胞介素-12B基因+1188位点基因多态性与HBV宫内感染易感性的研究[A];2006（第三届）江浙沪儿科学术会议暨浙江省儿科学术年会论文汇编[C];2006年

8 俞惠民;;宫内感染与胎儿炎症反应综合征[A];2009年浙江省围产医学学术年会暨“围产医学热点问题”专题学术论坛论文汇编[C];2009年

9 徐剑秋;俞纯芝;刘晓英;门可;;产前应用乙肝免疫球蛋白阻断乙肝病毒宫内感染的研究[A];纪念卓越的人民医学家林巧稚大夫诞辰100周年——全国妇产科高级学术论坛论文集[C];2001年

10 陈倩;孙枫格;;宫内感染459例临床分析[A];中华医学会第二次全国产科热点问题研讨会及第一届全国产科主任论坛学术会议论文汇编[C];2004年

中国重要报纸全文数据库 前9条

1 陈汉桥;大连推出早期诊断HBV宫内感染新方法[N];中国医药报;2001年

2 孙克伟;宫内感染:乙肝免疫失败的一大症结[N];大众卫生报;2003年

3 华迅;母婴联合免疫预防HBV宫内感染[N];中国医药报;2004年

4 唐秀娣;宫内感染：乙肝免疫失败的一大症结[N];大众卫生报;2006年

5 北京地坛医院 蔡fg东;抗病毒药物可阻断HBV宫内感染[N];中国医药报;2013年

6 王雪飞 李水根;宫内感染可致早产儿脑瘫[N];健康报;2006年

7 湖南省妇幼保健院 曹霞;孕前先“排毒”[N];大众卫生报;2003年

8 刘道安 王兴梅;孕前治疗可有效提高乙肝阻断成功率[N];中国中医药报;2006年

9 刘跃梅;新生儿感染不一定发热[N];大众卫生报;2004年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 仲文玉;DNAC纳米材料治疗宫内感染孕鼠模型早产和子代脑损伤的研究[D];山东大学;2015年

2 詹灿阳;早期宫内感染对肺发育的影响及可能机制[D];浙江大学;2010年

3 谢新宝;HBV前C区和C启动子区变异与宫内感染及产前阻断关系的研究[D];复旦大学;2006年

4 宋秀霞;Toll样受体3与HBV感染和HBV宫内感染的关系及其作用机制的研究[D];山西医科大学;2008年

5 葛艳玲;IL-2和IL-12基因多态性与HBV宫内感染易感性的研究[D];复旦大学;2006年

6 沈盈;促红细胞生成素治疗宫内感染致新生大鼠脑白质损伤的研究[D];浙江大学;2009年

7 陈黎;HBV宫内感染体外模型的构建及cAMP调控子宫肌细胞COX-2表达的机制研究[D];第三军医大学;2011年

8 孙逸;脑内Toll样受体4信号在宫内感染致新生大鼠脑白质损伤中作用的研究[D];浙江大学;2010年

9 曹宝花;膜联蛋白V和Fcγ受体Ⅲ在胎盘的分布及其与HBV宫内感染关系的研究[D];第四军医大学;2004年

10 刘海智;小鼠巨细胞病毒宫内感染实验模型研究[D];华中科技大学;2006年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 冯珍珍;乙肝病毒复制水平、基因变异与母婴传播宫内感染关系的研究[D];河北医科大学;2015年

2 刘畅;新生儿乙型肝炎病毒宫内感染传播途径的分子机制研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2016年

3 邹璐;母胎转运与HBV宫内感染的研究[D];南昌大学;2008年

4 杨佳;乙型肝炎病毒基因结构异质性与宫内感染关系的探究[D];山西医科大学;2012年

5 潘文霞;孕期宫内感染400例临床分析[D];山东大学;2012年

6 方益荣;HBV宫内感染的流行病学研究[D];安徽医科大学;2005年

7 刘一萍;乙型肝炎病毒宫内感染的随访研究[D];第四军医大学;2004年

8 刘利芬;褪黑素对细菌脂多糖导致的宫内感染脑损伤的保护作用[D];苏州大学;2008年

9 冯永亮;HLA-DR等位基因与HBV宫内感染关系的研究[D];山西医科大学;2005年

10 史晓红;外周血单个核细胞HBV复制状况及与HBV宫内感染关系的研究[D];山西医科大学;2003年

，

本文编号：859045