CD47及其相关信号通路在噬血细胞综合征发病机制中的作用研究

发布时间：2017-09-29 17:12

  本文关键词：CD47及其相关信号通路在噬血细胞综合征发病机制中的作用研究

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【摘要】：第一部分不同转染方法对人T淋巴细胞白血病细胞Jurkat细胞转染效率的比较 研究目的 从转染效率和细胞毒性两方面探讨不同转染方法对siRNA转染Jurkat细胞的转染效率的影响。 研究方法 1.细胞培养：用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养Jurkat细胞，根据细胞生长情况，每2-3天进行换液、传代。 2.脂质体转染法： 2.1HiperFect○R转染试剂法： 取750ngsiRNA与12μlHiperfect○R转染试剂形成转染混合物，作用于Jurkat细胞24h后，用台盼蓝染色法检测细胞存活率，荧光倒置显微镜下观察转染效率。 2.2InstantFECT○R转染试剂法： 根据转染试剂与siRNA不同比分3组，分别为2μl转染试剂+30pmolsiRNA、与2μl转染试剂+60pmolsiRNA和3μl转染试剂+90pmolsiRNA，将形成的转染混合物作用于Jurkat细胞24h后，用台盼蓝染色法检测细胞存活率，荧光倒置显微镜观察转染效率。 3.NucleofectionTM○R电转法 不同程序（CL-120、CM-137、CM-158、CM-189、CU-150和DG-150）刺激Jurkat细胞24h后，用台盼蓝染色法检测细胞存活率，荧光倒置显微镜下观察转染效率。 结果 1.脂质体转染中，HiperFect○R转染试剂法和InstantFECT○R转染试剂法的细胞活性分别为（0.90±0.029）和（0.91±0.025），NucleofectionTM电转法中CL-120、CM-137、CM-158、CM-189、CU-150和DG-150程序下细胞活性分别为（0.87±0.018）、（0.22±0.29）、（0.35±0.04）、（0.31±0.015）、（0.57±0.025）和（0.32±0.02）。脂质体转染的两种方法以及电转中CL-120程序下，该3组间两两比较细胞活性差异无统计学意义（P＞0.05）。 2.脂质体转染中，HiperFect○R转染试剂法和InstantFECT○R转染试剂法的转染效率分别为（0.22±0.04）和（0.17±0.05），NucleofectionTM电转法中CL-120、CM-137、CM-158、CM-189、CU-150和DG-150程序下转染效率分别为（0.82±0.008）、（0.32±0.02）、（0.09±0.04）、（0.15±0.025）、（0.75±0.057）和（0.33±0.028）。脂质体转染的两种方法以及电转中CL-120程序下，该3组间两两比较转染效率差异有显著性意义（P＜0.05） 结论 从转染效率和细胞毒性两方面进行评估，NucleofectionTM○R电转法中的CL-120程序是一种转染Jurkat细胞的新的安全，有效的转染方法。 第二部分CD47在噬血细胞综合征发病机制中的作用研究 研究内容 选用Jurkat细胞株和HLH患儿骨髓来源的巨噬细胞为研究对象。利用细胞转染、流式细胞术等实验技术手段，改变细胞CD47的表达水平，观察CD47的不同表达水平对巨噬细胞吞噬作用的影响。 研究方法 1.骨髓来源巨噬细胞的体外培养：从HLH患儿骨髓中提取单个核细胞，以M-CSF诱导单个核细胞向巨噬细胞分化，待巨噬细胞诱导成功后，予IFN-γ和LPS刺激巨噬细胞向M1型分化，采用显微镜下形态学观察、流式细胞术等方法检测M1型巨噬细胞是否培养成功。 2.细胞转染法：详见第一部分Nucleofection○R电转法中CL-120程序。 3.流式细胞术： 3.1骨髓巨噬细胞培养鉴定，取不同时间（第5天，第8天）培养的巨噬细胞，，用CD11b-APC、CD14-FITC和F4/80-PE标记细胞，流式细胞术鉴定巨噬细胞分化情况。 3.2取不同CD47siRNA转染72h后得Jurkat细胞，CD47-FITC标记细胞，流式细胞术检测各组细胞膜表面CD47的表达情况。 4.U937细胞的活化：取2×104个U937细胞，并用20ng/mlIFN-γ和10ng/mlLPS刺激48h，用PBS洗3次后，备用； 5.细胞体外吞噬功能的检测： 取不同CD47表达情况的Jurkat细胞与活化的U937细胞或HLH患儿骨髓培养的巨噬细胞共培养2h，瑞士吉姆萨染色法检测细胞吞噬率，吞噬率＝（2００个巨噬细胞中吞噬Jurkat细胞的巨噬细胞数／2００个巨噬细胞）×１００％。 结果 1.巨噬细胞培养成功的鉴别方法：形态学方面，骨髓来源的单个核细胞经M-CSF诱导后第7天出现了巨噬细胞的典型形态；流式细胞术检测发现骨髓来源的单个核细胞经诱导后有（91.4±4.7）%细胞表达CD11b和F4/80；用20ng/mlIFN-γ和10ng/mlLPS刺激培养成功的巨噬细胞48h，光镜下观察细胞形态，细胞呈现长梭形，伪足较细长，为M1型巨噬细胞的典型形态，说明巨噬细胞培养成功。 2.流式细胞术比较转染不同si-CD4724h、48h、72h后细胞膜CD47表达，结果显示以si-CD47-3的抑制效果最好，差异有统计学意义（P＜0.05）；比较转染后24h、48h以及72h的CD47表达情况，发现以转染后48h抑制效果最佳，差异有统计学意义（P＜0.05）； 3.以活化的U937细胞为研究对象，发现si-CD47-1、si-CD47-2和si-CD47-3组巨噬细胞的吞噬率差异有统计学意义（P＜0.05））。将CD47的表达水平与细胞吞噬率做相关分析，结果发现CD47表达水平与吞噬率呈负相关（r=-0.925，p=0.001） 4.以HLH患儿和急性白血病（AL）患儿骨髓来源的巨噬细胞为研究对象，发现细胞膜上CD47的表达水平与巨噬细胞的吞噬作用成反比，即CD47的表达越低，巨噬细胞的吞噬作用越明显，并且与巨噬细胞的来源无关。在同一水平表达的的CD47，与对照组白血病患儿相比，HLH患儿骨髓来源的巨噬细胞的吞噬率无统计学意义。 结论 1.建立稳定的体外培养巨噬细胞体系； 2.不同位点的siRNA对CD47基因的抑制作用不同，以si-CD47-3的抑制效果最好；在转染CD47siRNA不同时间中，以转染后48h抑制效果最佳； 3.以活化的U937细胞和HLH患儿骨髓来源的巨噬细胞为研究对象，发现CD47的表达水平与细胞吞噬率呈负相关，与巨噬细胞的来源无关。 第三部分噬血细胞综合征临床及实验室检查特点分析 研究内容 选用临床资料作为研究对象，探讨HLH相关临床表现和实验室指标变化特点，评估HLH的早期诊断指标以及预后不良因素。 研究方法 采用回顾分析法对比分析好转病例、死亡病例的临床、实验室特点及治疗因素。 结果 1.将19例HLH患儿中分为好转组8例和死亡组11例，两组之间的热程、热峰、淋巴结肿大以及肝脾肿大的大小无统计学意义（P＞0.05）； 2.实验室检查：比较死亡组与好转组之间的各项实验室检查，发现血象降低程度（P=0.033）、凝血功能异常（P=0.020）以及凝血酶原时间（PT）异常（P=0.001）有统计学意义；异型淋巴细胞；活化部分凝血活酶时间(APTT）、LDH、ALT、AST、IgG、IgA、IgM和β2微球蛋白、SF水平、EBV-DNA负载量、EBV抗体谱以及骨髓中找到噬血细胞在两组之间无统计学意义（P＞0.05）。 3.SF动态变化：8例好转HLH患儿随着病情缓解，SF也随之下降，11例死亡患儿中10例患儿随病情进展，SF随之升高，其中1例患儿随病情进展SF下降，该患儿发病以神经系统受累为首发症状。 4.将19例HLH患儿与52例传染性单核细胞增多症和重症感染患儿用非参数假设下ROC曲线评价SF诊断HLH。SF的AUC为0.931，其中SF＞10000.00μg/L时，敏感度为22.22%，特异度为100.00%，SF＞3000.00μg/L时，敏感度为38.9%，特异度为100%，SF＞1000.00μg/L时，敏感度为83.33%，特异度为83.00%，SF＞500.00μg/L时，敏感度为100.00%，特异度为73.40%。 结论 1.血象降低的程度、纤维蛋白原降低的程度以及PT水平升高可能与预后不良有关。 2.SF＞3000μg/L时，可作为初步诊断HLH的可靠指标。 3.血清SF越高，越具有诊断为HLH的价值，但SF水平与预后无关，其动态变化可作为预后评估指标。
【关键词】：噬血细胞综合症 转染方法 CD47 流式细胞术 发病机制 临床特点
【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R725.5
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-14
• 前言14-17
• 第一部分 不同转染方法对人T淋巴细胞白血病细胞Jurkat细胞转染效率的比较17-26
• 研究内容17
• 主要材料和试剂17-18
• 研究方法和结果18-26
• (一) 研究方法18-21
• （二）结果21-26
• 第二部分 CD47 在噬血细胞综合征发病机制中的作用研究26-36
• 1. 研究内容26
• 2. 主要材料和试剂26-28
• 研究方法和结果28-36
• 第三部分 噬血细胞综合症临床及实验室检查特点分析36-45
• 1．研究对象和方法37-38
• 2. 结果38-42
• 3. 讨论42-45
• 4. 结论45

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