CXCL16基因沉默在减轻ox-LDL引起的足细胞损伤中的作用研究

发布时间：2017-09-30 07:27

  本文关键词：CXCL16基因沉默在减轻ox-LDL引起的足细胞损伤中的作用研究

  更多相关文章： 足细胞 CXC趋化因子配体16 氧化低密度脂蛋白 活性氧 β1整合素

【摘要】：研究背景与研究目的原发性肾病综合征(Primary nephrotic syndrome, PNS)是儿童时期常见的肾小球疾病之一,约占小儿时期肾病综合征(Nephrotic syndrome, NS)的90%。高脂血症和高脂蛋白血症是PNS重要的病理生理特征之一。研究表明,氧化应激、炎症应激、内质网应激等是引起慢性肾脏疾病的可能机制。脂质在肾脏的过多沉积将致使肾功能障碍,然而,脂质引起肾脏损伤的具体机制尚未明确。近年来研究表明,氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-LDL)对肾脏系膜细胞、内皮细胞以及足细胞均可造成损伤。在许多肾小球疾病中,如糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)、微小病变肾病综合征(Minimal change disease nephrotic syndrome, MCNS)、局灶性节段性肾小球硬化(Focal segmental glomerular sclerosis, FSGS)及膜性肾病(Membranous nephropathy, MN),足细胞是最主要的受损部位和早损指标。足细胞是高度分化的肾脏固有细胞,其通过足突覆盖于肾小球基底膜(glomerular basement membrane, GBM)表面,构成肾小球滤过的最后屏障。当足细胞受到损伤时,将导致蛋白尿的产生。目前,ox-LDL引起足细胞损伤的机制尚不明确。CXC趋化因子配体16 (chemokine ligand 16, CXCL16)是近年来发现的一种趋化因子,其集清道夫受体功能及炎性趋化因子功能于一身,是CXC趋化因子家族中独特的一种,在免疫反应及炎症等多方面有重要作用。早期对于CXCL16的研究主要集中于动脉粥样硬化。近期研究发现CXCL16参与了多种肾脏疾病的疾病过程[4-5]。本课题前期研究显示,CXCL16参与阿霉素肾病,其可能作为ox-LDL的清道夫受体,协助足细胞摄取ox-LDL[6]。然而,在原发性肾病综合征中,CXCL16介导ox-LDL引起足细胞损伤的具体机制尚不明确。脱落和凋亡是目前已知的足细胞减少的主要原因。β1整合素是足细胞基底膜上重要的粘附分子,其与足细胞的粘附功能及脱落有重要联系并且在细胞内外信号传导中发挥作用。β1整合素表达量的下降可导致足细胞黏附力降低引起足细胞脱落,足细胞脱落与肾小球硬化有重要联系。Chen等报道β1整合素表达量的减少伴有足细胞数量的减少。关于足细胞凋亡,活性氧(reactive oxygen species, ROS)是近来的研究热点之一。足细胞是终末分化细胞,其内有大量的线粒体存在以维持其对能量的需求。当线粒体受到损伤时,必定引起足细胞的功能障碍。当细胞受损时,线粒体外膜通透性增加,可引起细胞凋亡,氧化呼吸链上电子丢失使部分氧形成ROS。线粒体的损伤及ROS的产生可进一步导致足细胞的损伤及大量ROS的形成,导致恶性循环。目前,在PNS中,关于CXCL16是否通过介导ox-LDL进入足细胞引起ROS以及β1整合素变化,国内外尚未有所研究。为此,本实验通过慢病毒转染小鼠足细胞,建立小鼠足细胞CXCL16基因沉默模型,观察ox-LDL作用下足细胞β1整合素及ROS的表达变化,探讨CXCL16在ox-LDL引起足细胞损伤的机制。研究CXCL16基因沉默后,能否减少ox-LDL引起的细胞损伤而发挥细胞保护作用。方法体外培养永生化小鼠足细胞,CXCL16-shRNA慢病毒及阴性对照慢病毒转染足细胞建模,荧光倒置显微镜观察慢病毒转染效果,Western blotting及Real-time PCR检测CXCL16沉默效率。CCK8法检测阴性对照慢病毒转染组(NC组)及CXCL16-shRNA慢病毒转染组(CXCL16-shRNA组)足细胞活力差异。将NC组及CXCL16-shRNA组分别用ox-LDL处理,总胆固醇含量测定估计细胞内脂质沉积,Western blotting检测CXCL16及β1整合素变化,ROS深红色染料检测ROS表达。结果1.慢病毒转染效果 以MOI=50进行转染后可见明显绿色荧光,且MOI=50时细胞状态良好,确定足细胞的最优MOI为50。为保持细胞在增值过程中转染率,采用二盐酸嘌呤霉素对其筛选,根据预实验确定嘌呤霉素1ug/mL对筛选转染细胞,筛选后荧光观察感染率90%。2.CXCL16-shRNA慢病毒感染效率慢病毒转染及二盐酸嘌呤霉素筛选后,CXCL16-shRNA组较NC组CXCL16蛋白表达水平显著下降(Z=2.61,P0.05),蛋白表达水平下降约60%；CXCL16-shRNA组较NC组CXCL16 mRNA表达水平显著下降(Z.-2.61,P0.05),mRNA表达水平下降约70%。3.足细胞活力测定 阴性对照转染组及CXCL16-shRNA组足细胞活力无显著差异(Z=0.369,P0.05)。4.细胞内总胆固醇含量ox-LDL作用后,24h至72h细胞内总胆固醇含量增加。作用72h,ox-LDL组总胆固醇含量明显增加,ox-LDL组细胞内总胆固醇含量高于NC组、CXCL16-shRNA组、ox-LDL+CXCL16-shRNA组(P0.05).5.ox-LDL处理后CXCL16及β1整合素表达量变化ox-LDL处理48h后,CXCL16表达量增加,随时间延长无显著增加(F=19.24,P0.05)。β1整合素在处理48h后出现减少,随时间延长表达进一步减少,72h有明显减少(F=54.15,P0.001)。ox-LDL处理72h后,ox-LDL组及ox-LDL+CXCL16-shRNA组均有β1整合素表达量下降,且ox-LDL组低于NC、CXCL16-shRNA. ox-LDL+CXCL16-shRNA组,差异有统计学意义(F=51.12,P0.001)。6.细胞内ROS测定通过荧光强度检测ox-LDL作用下ROS的产生,阴性对照转染组、CXCL16-shRNA组、ox-LDL+CXCL 16-shRNA转染组ROS表达量均少于ox-LDL组,差异有统计学意义(F=307.57,P0.001)。结论1.MOI=50时可获得满意的病毒转染效果,提示以MOI=50转染40-48h进行造模。2.与阴性对照相比,CXCL16-shRNA转染组足细胞CXCL16蛋白表达明显减少,提示建模成功。3.与阴性对照相比,CXCL16-shRNA转染组足细胞活力无显著性差异,提示两组细胞活性无差异,可进一步探讨ox-LDL作用下的两组细胞的损伤差异。4.在ox-LDL作用下,阴性对照组细胞内脂质沉积明显高于CXCL16-shRNA转染组足细胞,差异有统计学意义,提示CXCL16基因沉默后,脂质的摄取减少,CXCL16是ox-LDL的清道夫受体。5.在ox-LDL作用后,细胞内ROS表达增加,p1整合素表达降低,提示ox-LDL可通过改变ROS及p1整合素的表达而损伤足细胞。6.CXCL16基因沉默后,ROS产生减少,β1整合素表达增加,提示CXCL16基因沉默能减轻ox-LDL对足细胞的损伤,起到细胞保护作用。
【关键词】：足细胞 CXC趋化因子配体16 氧化低密度脂蛋白 活性氧 β1整合素
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R726.9
【目录】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 符号说明14-15
• 前言15-17
• 材料与方法17-31
• 结果31-33
• 讨论33-39
• 结论39-40
• 创新性与局限性40-41
• 附表41-42
• 附图42-45
• 参考文献45-49
• 致谢49-50
• 攻读学位期间发表的学术论文目录50-51
• 学位论文评阅及答辩情况表51

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 陈洪宇;吴文斌;王永钧;;肾脏病足细胞损伤及其防治研究进展[J];医学研究杂志;2007年11期

2 王惠;何方方;张春;;足细胞损伤机制研究进展[J];中国中西医结合肾病杂志;2008年11期

3 洪亦眉;陈朝红;;足细胞损伤的病因和发病机制[J];肾脏病与透析肾移植杂志;2009年01期

4 暴小方;黄国东;;中医药对肾脏足细胞损伤干预作用的研究进展[J];内科;2013年03期

5 王庆苗;魏锦慧;;中药防治足细胞损伤研究进展[J];中医研究;2014年05期

6 李芙蓉;郑春霞;;可溶性尿激酶型纤溶酶原激活物受体与局灶节段性肾小球硬化[J];肾脏病与透析肾移植杂志;2014年01期

7 李振勇;倪兆慧;;足细胞损伤的干预研究进展[J];国际泌尿系统杂志;2006年04期

8 黄国东;许健;乔莉;;肾足细胞损伤中西医治疗的国内研究进展[J];时珍国医国药;2009年12期

9 邬民香;罗群;;糖尿病肾病足细胞损伤机制研究进展[J];现代实用医学;2012年05期

10 肖厚勤,张建鄂,丁国华;足细胞损伤与肾小球硬化[J];国外医学.泌尿系统分册;2004年04期

中国重要会议论文全文数据库 前8条

1 黄国东;许健;;肾足细胞损伤治疗的国内研究进展[A];第10届全国中西医结合肾脏病学术会议论文汇编[C];2009年

2 郭兆安;;中药及其有效成分防治足细胞损伤研究进展[A];第十一届全国中西医结合肾脏病学术会议论文汇编[C];2010年

3 刘志红;;足细胞损伤的研究[A];2012年浙江省肾脏病学术年会论文集[C];2012年

4 冯泉城;苗静;姜丽娜;李雪娟;张晓燕;丁洁;;补体C3在足细胞损伤中的作用[A];中华医学会第十七次全国儿科学术大会论文汇编（上册）[C];2012年

5 刘双信;史伟;梁馨苓;李珩;叶智明;王文健;何朝生;梁永正;骆宁;刘艳辉;胡湘明;章斌;彭炎强;马健超;;RANK可能是足细胞损伤标志[A];中华医学会肾脏病学分会2006年学术年会论文集[C];2006年

6 范青锋;张涵;刘淑芳;余自华;管娜;邢燕;丁洁;;突变podocin通过TRPC6介导的钙离子内流诱导足细胞损伤[A];中华医学会第五次全国儿科中青年学术交流大会论文汇编（上册）[C];2008年

7 饶佳;徐虹;杨海春;郝伟明;;嘌呤霉素诱导足细胞损伤中ANGPTL3对硫酸肝素蛋白多糖表达的影响[A];中华医学会第十四次全国儿科学术会议论文汇编[C];2006年

8 王文琰;张爱华;袁杨刚;朱春华;黄松明;;自噬早期激活可抑制醛固酮诱导的足细胞损伤[A];2012年江浙沪儿科学术年会暨浙江省医学会儿科学分会学术年会、儿内科疾病诊治新进展国家级学习班论文汇编[C];2012年

中国博士学位论文全文数据库 前8条

1 徐维玮;糖原合成酶激酶3β调节足细胞骨架在足细胞损伤机制及治疗中的作用[D];南京大学;2014年

2 汤曦;局灶节段性肾小球硬化足细胞损伤标志物及凝血功能异常的研究[D];南京大学;2011年

3 朱春华;线粒体功能障碍在足细胞损伤中的作用及干预研究[D];南京医科大学;2011年

4 黄轶嵘;肾脏缺血再灌注中足细胞损伤机制的研究[D];山西医科大学;2008年

5 陈珊;TRPC6介导的钙离子内流在白蛋白过负荷所致足细胞损伤中的作用[D];华中科技大学;2011年

6 高丹;氯沙坦改善5/6肾切除大鼠生存率及修复足细胞损伤的实验研究[D];郑州大学;2012年

7 袁杨刚;线粒体功能障碍在肾小球足细胞早期损伤中作用的研究[D];南京医科大学;2012年

8 邢玲玲;P13K/Akt通路在糖尿病肾病足细胞损伤中的作用[D];河北医科大学;2012年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 杨向贵;miR-135能促进wnt信号通路介导的足细胞损伤[D];重庆医科大学;2015年

2 夏虹;Toll样受体9（TLR9）在足细胞损伤中的作用[D];南京大学;2014年

3 鲍文朵娜;Toll样受体-9在足细胞损伤中的作用及其机制研究[D];南京大学;2016年

4 王雪;CXCL16基因沉默在减轻ox-LDL引起的足细胞损伤中的作用研究[D];山东大学;2016年

5 胡梦思;粘着斑激酶在氧化低密度脂蛋白诱导的体外足细胞损伤中的作用研究[D];山东大学;2013年

6 部璇;肝细胞生长因子保护足细胞损伤的实验研究[D];南京医科大学;2010年

7 柳林芬;骨髓间充质干细胞对脂多糖诱导的足细胞损伤的影响及可能机制[D];福建医科大学;2014年

8 姚琴;TRPC6在足细胞的表达及其与足细胞损伤修复相关性研究[D];大连医科大学;2008年

9 王惠;瞬时受体电位阳离子通道蛋白6在高糖所致足细胞损伤中的作用及机制[D];华中科技大学;2011年

10 胡鹤一;骨髓间充质干细胞对大鼠足细胞损伤的保护作用的研究[D];福建医科大学;2012年

，

本文编号：946889