载紫杉醇靶向磁性纳米探针双模态显像及治疗乳腺癌的实验研究

发布时间：2017-10-25 10:27

  本文关键词：载紫杉醇靶向磁性纳米探针双模态显像及治疗乳腺癌的实验研究

  更多相关文章： 探针 USPIO 紫杉醇 靶向 Herceptin 乳腺癌 探针 高频 超声 磁共振成像 紫杉醇 治疗 靶向 乳腺癌 纳米探针

【摘要】：第一部分 载紫杉醇靶向磁性纳米探针的制备及性能目的1.制备一种新型智能探针载紫杉醇靶向磁性纳米探针(Paclitaxel-loaded targeted magnetic nanoprobe, PTX-USPIO-HER-NBs),并对其基本性质进行检测。2.探讨载紫杉醇靶向磁性纳米探针体外细胞寻靶能力及对细胞活性的影响方法1.以PEG化端羧基PLGA作为成膜材料,采用双乳化法及碳二亚胺化学连接法,制备装载不同含量超小型超顺磁性氧化铁(Ultasmall superparamagnetic iron oxide, USPIO)的PTX-USPIO-HER-NBs探针,并对其粒径、电位、表面形态、载铁量等进行检测；用振动样品磁强计检测其磁学性能；采用高效液相色谱法检测探针中紫杉醇的包封率及载药量,连续观察30天内体外药物释放特征；免疫荧光法检测Herceptin是否成功连于探针表面,并用BCA蛋白浓度检测探针表面曲妥珠单抗连接量。2.体外培养高表达HER2的乳腺癌细胞株SK-BR-3与低表达细胞株MDA-MB-231,观察超声辐照对靶向探针与细胞结合能力的影响,并设置Herceptin干预组及非靶向探针组进行对照,评价其体外寻靶能力。CCK8法检测所制备探针对细胞活性的影响,并设置多组对照,对探针各种成分的细胞毒性进行探讨。结果1.光镜及扫描电镜观察所制备探针形态规则,呈球形,表面光滑,分散性好,大小较均匀,粒径约285.8±98.97nm,较非靶向探针粒径偏大。透射电镜结果显示探针为壳核结构,USPIO分布于壳膜中,且其分布具有随机性,随着制备时USPIO投入量的增加,USPIO在壳膜上的装载量增加,但包封率降低。VSM显示PTX-USPIO-HER-NBs具有超顺磁性和强磁性。HPLC法测得探针中紫杉醇的包封率为(69.24±0.05)%,载药量为(6.92±0.13)%,观察在体外30天内具有良好的缓释性能,在超声辐照下可加快药物的释放。免疫荧光法结果显示靶向探针组因FITC标记二抗的结合而显示绿色荧光,BCA蛋白浓度检测Herceptin表现连接量为14±0.037mg/g探针。2.体外细胞寻靶实验显示超声辐照下,靶向探针不仅附着于SK-BR-3细胞表面,细胞浆内亦见较多探针分布,视野内平均每个细胞结合探针荧光强度为3345.76±141.96,远远高于非辐照组、Herceptin干预组及非靶向组。CCK8法结果显示,PTX-USPIO-HER-NBs在超声辐照下对SK-BR-3的细胞毒性最大,高分子材料及USPIO对细胞活性影响不大,具有良好的安全性。结论所制备的探针具有良好的载紫杉醇及USPIO的能力,表面可经抗体修饰而具有靶向性,在体外对HER2受体高表达SK-BR-3细胞有良好的寻靶向能力,并对该细胞有特异性的毒杀效能。目的观察PTX-USPIO-HER-NBs体外增强磁共振、超声的效果,探讨其作为双模式显像剂的可行性；于体内实验观察PTX-USPIO-HER-NBs对裸鼠SK-BR-3移植瘤US/MRI双模式成像效果,了解PTX-USPIO-HER-NBs增强US/MRI的能力及原理。方法1.配置不同铁浓度的PTX-USPIO-HER-NBs悬液,应用1.5T磁共振扫描仪采集FSPGR-T2*WI图像,测得各样品的R2*值,评价所制备探针负性强化效果。配置不同NBs浓度的PTX-USPIO-HER-NBs,应用超声诊断仪采集Bmode及造影模式图像,并利用DFY分析各浓度的灰阶强度。2.建立裸鼠SK-BR-3移植瘤模型,选择15只随机分为三组,分别经尾静脉注入生理盐水、PTX-USPIO-NBs及PTX-USPIO-HER-NBs。采用小动物线圈经3.0T磁共振采集不同时间点的T2WI图像,测量各时间点增强前后同一层面裸鼠肿瘤及大腿肌肉感兴趣区的信号强度值(Signal intensity, SI) SItumor及SImuscle,计算相对信号强度(Relative signal intensity, Sir)及信号强度降低率(Percentage of signal intensity loss, PSIL)。同样的分组方法,利用PanoViewβ1500高频超声显像仪的造影模式进行超声显影实验。造影前平扫100帧图像作为造影前对照图像,注射造影剂后继续采集1000帧,采集时间在不少于60min。选择图像上肿瘤感兴趣区(Region of interesting, ROI),绘制随时间变化的回声增强强度曲线图(Time intensity curve, TIC),随时间变化的视频强度曲线图(Video intensity curve, VIC),在该软件是指造影前后在肿瘤内呈现的探针所占百分比,比较各组造影前后在图像灰度增强值(Gary scaleintensity, GSI)及视频强度增加率(Percentage of video intensity, VI%)上的差异。结果1.体外磁共振显影结果显示,所制备PTX-USPIO-HER-NBs磁性探针的T2*信号强度随着铁浓度的增加而降低,随着样品铁含量的增加,其信号降低百分比(PSIL)逐渐增加；横向弛豫率R2*与铁浓度间存在着线性关系。体外超声显影结果显示,随着NBs浓度的增加,样品显示为回声强度逐渐增高,回声呈点状,细小,均匀,造影模式下造影效果也逐渐增强。载铁探针与非载铁探针相比,前者回声强度明显高于后者,p0.05,差异具有统计学意义。2.SK-BR-3移植瘤裸鼠模型体内MR成像的研究结果表明,生理盐水组注射前后,肿瘤信号强度无明显变化,不同时间点信号强度降低百分比(PSIL)相比,p0.05,差异无统计学意义；非靶向探针PTX-USPIO-NBs和靶向探针PTX-USPIO-HER-NBs经尾静脉注射后,首先可观察到肝脏信号强度降低；随扫描时间延长,肿瘤组织的信号强度逐渐降低,靶向探针组较非靶向探针组降低更为明显,p0.05,差异具有统计学意义。体内增强超声结果显示生理盐水对照组于造影前后图像回声强度未见明显变化；与生理盐水对照组比较,非靶向探针组与靶向探针组图像回声强度均有增强；靶向探针组与非靶向探针组比较,GSI与Ⅵ%均明显增高,p0.05,差异有统计学意义。结论PTX-USPIO-HER-NBs在体外能够增强超声、磁共振显像。体内实验中,PTX-USPIO-HER-NBs可靶向聚集于肿瘤组织,具有增强乳腺癌超声、磁共振双模式成像的能力,同时携载紫杉醇可进一步实现影像引导下的可视化治疗,为乳腺癌的诊断与治疗提供了一种新的思路。目的探讨PTX-USPIO-HER-NBs在裸鼠各脏器内的分布；进一步联合超声促进药物释放对裸鼠SK-BR-3移植瘤的治疗效果。方法1.选取10只SK-BR-3移植瘤裸鼠进行小动物活体成像,随机分为两组：非靶向探针(DiI/PTX-USPIO-NBs)组和靶向探针(DiI/PTX-USPIO-HER-NBs)组,每组5只,经尾静脉缓慢注射探针,每只注射用量为05ml (10mg/ml)。继续培养24h后,小动物活体荧光成像仪采集图像并对比观察各处理组肿瘤局部的荧光强度,利用Maestro软件系统对图像进行定量分析。2.选5只荷双瘤裸鼠模型,右侧肿瘤给予超声辐照,左侧肿瘤作为对照不用超声辐照,经尾静脉注射经DiI标记的靶向探针24小时后,断颈处死裸鼠,将肿瘤组织、脑组织、肝脏、脾脏、肾脏及肺脏取出,迅速送到病理科做成冰冻切片。DAPI染色后,激光共聚焦显微镜下观察各脏器内荧光分布情况,并定量峰每张图片的积分光密度值(integrated optical density, IOD)。3.选取25只裸鼠SK-BR-3移植瘤模型,随机分为5组进行实验,分别为生理盐水对照组(contr。1)、单纯紫杉醇药物组(PTX)、非靶向探针组(PTX-USPIO-NBs)、靶向探针组(PTX-USPIO-HER-NBs)和靶向探针+超声辐照组(PTX-USPIO-HER-NBs+US)。每只裸鼠紫杉醇用量为25mg/kg。根据探针药物载药量调整为相应的含药浓度。各组给予相对应药物浓度,治疗间隔3天,共3次。定期测量肿瘤体积大小,于治疗后剥取肿瘤组织,称取质量,计算肿瘤抑瘤率(Tumor inhibition rate, TIR)。用免疫组化法检测肿瘤组织PCNA、CD34的表达,计算细胞增殖指数(Proliferation index, PI)和微血管密度(Microvessel density, MVD), TUNEL法检测肿瘤细胞的凋亡,计算肿瘤细胞凋亡指数(Apoptotic index, AI)。结果1.小动物活体荧光成像结果显示非靶探针组在肿瘤内部几乎观察不到荧光；靶向探针组可见经DiI标记的靶向探针在肿瘤内部聚集发出红色荧光。Maestro软件系统分析荧光强度见靶向探针组荧光强度明显高于非靶向组,p0.05,差异具有统计学意义。2.激光共聚焦显微镜观察各脏器冰冻切片结果显示,裸鼠肿瘤及肝、脾、肾、肺、脑组织中均含有不同浓度的对比剂,24h后肝脏内探针荧光强度与超声辐照侧肿瘤相比,P0.05,差异无统计学意义。超声辐射侧肿瘤内的荧光明显高于非辐射侧肿瘤,两者相比P0.05,差异具有统计学意义。裸鼠体内其他脏器的荧光强度分布程度也各不相同,以肝、脾分布最多,脑组织分布最少。3.分组治疗结果显示,PTX-USPIO-HER-NBs+US组肿瘤体积生长最慢,质量抑瘤率最高,治疗效果优于其他组。TUNEL法检测PTX-USPIO-HER-NBs+US组肿瘤细胞凋亡指数显著高于其他治疗组；免疫组化法测得PTX-USPIO-HER-NBs+US组的增殖指数明显高于其他组；微血管密度最小,明显低于其他组(P0.05)。结论所制备PTX-USPIO-HER-NBs探针联合超声辐照可增强其在SK-BR-3移植瘤内的聚集,所携带药物在肿瘤组织内缓慢释放,可以抑制癌细胞的细胞增殖,促进其凋亡。PTX-USPIO-HER-NBs是一种有应用前景的集显像与治疗为一体的多功能分子探针。
【关键词】：探针 USPIO 紫杉醇 靶向 Herceptin 乳腺癌 探针 高频 超声 磁共振成像 紫杉醇 治疗 靶向 乳腺癌 纳米探针
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R445.2;R737.9
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照6-8
• 中文摘要8-15
• 英文摘要15-27
• 前言27-33
• 参考文献30-33
• 第一部分 载紫杉醇靶向磁性纳米探针的制备及性能检测33-66
• 前言33
• 第一节 载紫杉醇靶向磁性纳米探针制备及表征33-51
• 1 材料和设备33-37
• 2 结果37-41
• 3 讨论41-44
• 参考文献44-47
• 附图47-51
• 第二节 载紫杉醇靶向磁性纳米探针体外寻靶及细胞毒性实验51-66
• 1 材料与设备51-53
• 2 结果53-57
• 3 讨论57-60
• 参考文献60-63
• 附图63-66
• 第二部分 载紫杉醇靶向磁性纳米探针增强超声/磁共振双模式显像实验研究66-85
• 前言66-67
• 1 材料与仪器设备67-68
• 2 实验方法68-70
• 3 结果70-73
• 4 讨论73-78
• 参考文献78-82
• 附图82-85
• 第三部分 载药靶向磁性探针体内生物学分布及治疗裸鼠乳腺癌85-105
• 前言85
• 1 材料与仪器85-86
• 2 实验方法86-88
• 3 结果88-93
• 4 讨论93-96
• 参考文献96-99
• 附图99-105
• 全文总结105-107
• 文献综述107-115
• 参考文献111-115
• 致谢115-117
• 攻读学位期间发表的学术论文、参研项目、学术交流目录117

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