新型叶酸靶向有机自由基磁共振造影剂的制备与MR成像研究

发布时间：2018-02-21 06:05

本文关键词： 有机自由基 TEMPO 叶酸受体磁共振成像 Hela细胞　出处：《南方医科大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景核磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)技术是目前作为最方便的非侵入性成像技术广泛应用于临床诊断。相对其他成像技术,MRI有绝对的优势,例如,固有的高空间分辨率、无放射性辐射、快速采集体内图像和长效成像等。MRI能提供高质量软组织3D图像和解剖高分辨率的图像用于观察药物的转运,检测体内生物学过程和功能上的改变。在过去的几十年,MRI研究中最活跃的邻域是研制具有高弛豫性,良好生物相容性和选择性靶向器官或组织的MRI对比剂。MRI造影剂是用来增强正常组织之间、正常与病变组织之间的磁共振信号对比度的一类化学试剂。通过采用造影剂可以帮助提高成像的灵敏度和对比度。例如,能导致T2加权MR图像暗对比的超顺磁性氧化铁(SPIO)纳米微粒,在临床应用方面,作为阴性对比剂,从造影剂非靶向聚集于特定组织观察疾病发展到细胞生物分子标记物的靶向监测都有研究。另外,顺磁性金属离子复合物,如Gd3+和Mn2+能使周围水质子产生显著自旋晶格弛豫,引起T1加权MR图像形成明亮的阳性对比增强效应。目前MRI检查超过30%应用的是顺磁性Gd3+复合物。但是金属离子造影剂也存在严重的问题,例如钆造影剂应用于肾功能不全患者也增加了肾源性系统性纤维化(Nephrogenic Systemic Fibrosis,NSF)的发生机率。回顾性研究发现自1993年首次报道使用了钆双胺的患者发现NSF以来,NSF的增加和我们逐渐增加使用钆双胺来实现MRI增强呈平行增长,引起了关注。目前认为出现NSF可能是钆双胺中释放出来的游离Gd的毒性反应,游离Gd有剧毒,特别是它的离子形态(Gd3+),而在肾病患者中Gd对比剂会有更长的半衰期,限制了这类造影剂用于严重肾功能不全患者。为了避免这些问题的出现,研究者一方面针对现有顺磁性金属类造影剂,通过提高对比剂螯合物的稳定性,得到高弛豫率和有效性的小剂量低暴露的自由钆离子,提高对比剂的效用和安全性；另一方面,致力研发合成生物相容性好、安全性能高、成像效果好、在体内有适当的滞留时间且易于排泄的新型T1造影剂,如顺磁性的有机稳态自由基类复合物。有机自由基是指由氮氧化合物形成的自由基,因拥有孤立不成对电子而具有顺磁性这一特性,可以用于临床磁共振成像对比增强。以2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(2,2,6,6-Tetramethylpiperidinooxy,TEMPO)为代表的六哌啶类稳态有机自由基,因其自旋孤立电子产生的超磁性,具有高T1弛豫性能。所以非金属的有机自由基对比剂能提供一个除了钆类阳性对比剂外的另一种选择。本研究即是以聚乙炔(Polyacefylene,PA)作为良好的载体,2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(2,2,6,6-Tetramethylpiperidinooxy,TEMPO)作为磁性物质,通过引入PEG链提高亲水和长循环特性,制备一种新型的具有良好水溶性、长循环及高T1弛豫性能的有机自由基MRI造影剂(PA-TEMPO)。并通过靶向基团叶酸(Folic Acid,FA)及荧光素(Fluorescein,FI)链接到PA上对有机自由基造影剂进行修饰,制备叶酸修饰、荧光素FI标记的新型靶向磁共振造影剂(PA-TEMPO-FI-FA),用于叶酸受体高表达肿瘤的早期诊断。目的制备叶酸修饰、荧光素标记的含非金属稳态有机自由基的靶向特异性造影剂(PA-TEMPO-FI-FA),利用Hela阳性肿瘤细胞的裸鼠模型,探讨该大分子造影剂对肿瘤靶向成像的可行性及体内成像特点。第一章磁共振造影剂应用及研究进展第二章新型有机自由基磁共振造影剂的制备与体外表征 2.1材料与方法 2.1.1含TEMPO聚丙炔胺衍生物磁共振造影剂PA-TEMPO的制备采用丙炔胺、丁二酸酐、4-羟基TEMPO和PEG2K聚合反应生成含TEMPO聚丙炔胺衍生物(PA-TEMPO)。 2.1.2单独荧光标记的磁共振造影剂PA-TEMPO-FI、叶酸修饰和荧光素标记的靶向磁共振造影剂PA-TEMPO-FI-FA的制备 PA-TEMPO与FI反应,合成了具有荧光标记的PA-TEMPO-FI;PA-TEMPO与FA和FI反应,合成含PA-TEMPO的靶向特性造影剂]'A-TEMPO-FI-FA大分子物质。 2.1.3新型有机自由基磁共振造影剂理化特性的初步研究：采用红外光谱仪和核磁共振谱仪对含TEMPO乙炔衍生物1,含PEG2K乙炔衍生物2和有机自由基磁共振造影剂(PA-TEMPO)进行检测。 2.2结果丙炔胺衍生物1和丙炔胺衍生物2单体用波谱分析,得到的数据与其分子结构相符。分析PA-TEMPO的波谱,证明丙炔胺衍生物1和丙炔胺衍生物2单体聚合反应后成功得到聚丙炔胺衍生物PA-TEMPO. 第三章新型有机自由基磁共振造影剂的评价第一节新型有机自由基磁共振造影剂体外性能评价 3.1材料与方法 3.1.1体夕(?)PA-TEMPO、PA-TEMPO-FI和PA-TEMPO-FI-FA细胞毒性采用MTT法检钡(?)Hela细胞的相对存活率：Hel细胞用完全培养基常规培养在37℃,50%C02和95%大气压环境下,将Hela细胞接种于96孔板中(6×103个/孔),继续培养一段时间后,分别加入含不同浓度的PA-TEMPO、PA-TEMPO-FI及PA-TEMPO-FI-FA溶液培养。培养24h后,加入10uL浓度为5mg/ml的MTT的D-hanks溶液,继续孵化4h,加入150ml DMSO,平板震荡仪震荡10min,在酶标仪(BioTech ELX800instamaents)中测定490nm波长处的吸光度值(OD值),不含样品溶液培养的细胞作为对照组。细胞存活率=(实验组OD值-对照组OD值)／对照组OD值×100%。统计学分析：采用SPSS20.0软件包,利用完全随机分组两因素析因设计法分析资料,并对结果进行方差分析,考察两个处理因素对细胞毒性影响的差异是否有显著统计学意义,P0.05则认为有显著性差异。 3.1.2检测(?)PA-TEMPO.PA-TEMPO-FI和PA-TEMPO-FI-FA体外磁共振T1信号及弛豫效能 PA-TEMPO、PA-TEMPO-FI及PA-TEMPO-FI-FA用PBS稀释,浓度为1、3、5、10mM并与PBS分装于5只试管中,置于塑料试管架上,在3.0TMR机器上进行T1扫描,采用8通道头部线圈,扫描序列采用SE T1WI及T1mapping,随后测量各个浓度试管中部T1信号值及T1弛豫时间,取其平均值,计算样品的T1信号值及T1弛豫率,弛豫率r1即是PA-TEMPO、PA-TEMPO-FI及PA-TEMPO-FI-FA溶液浓度与1/T1直线方程的斜率。 3.1.3体外细胞摄取荧光成像将Hela细胞悬液接种于24孔板中(1×104个/孔)的爬片上过夜后加入含PA-TEMPO-FI(对照组)或PA-TEMPO-FI-FA(实验组)溶液,浓度分别是3.0mM及单纯培养基设定为空白组。培养2h后,用多聚甲醛固定细胞并用DAPI染细胞核,洗涤三次。爬片置于载玻片上,甘油封片后,置于荧光显微镜下观察。 3.1.4体外细胞MRI成像将Hela细胞悬液接种于6孔板中(2×104个/孔)中,培养48小时后加入PA-TEMPO-FI(对照组)或PA-TEMPO-FI-FA(实验组)溶液,浓度为0-5.0mM;单纯培养基设定为空白组。培养4h后,取出细胞离心后用0.1%琼脂糖凝胶混匀,置于塑料架上进行3.0T磁共振扫描,采用8通道头部线圈,扫描序列采用T1WI,随后测量各个浓度试管中部T1信号值及背景信号值,计算样品的信号噪声比。第二节新型有机自由基磁共振造影剂的体内研究 3.2材料与方法 3.2.1裸鼠肿瘤模型的建立：取O.1mL(5x106个)Hela细胞悬液,接种在BALB/c裸鼠右侧肩背部皮下,饲养并定期观察,待肿瘤直径达1-2cm,即可开始后续实验。 3.2.2磁共振靶向对比剂PA-TEMPO-FI-FA在肿瘤裸鼠中的活体荧光观察与组织分布研究；实验时,用0.3%戊巴比妥钠对裸鼠进行腹腔内注射麻醉,麻醉剂量约为0.3-0.5mL(裸鼠体重25-30克),经鼠尾静脉注入制备的靶向对比剂PA-TEMPO-FI-FA溶液(PBS为溶剂),造影剂的浓度全部为5mM,每只小鼠药量约为2.5mmol,注射0.5mL；注射前及注射成功后不同时间点进行裸鼠活体荧光显像。为了进一步分析PA-TEMPO-FI-FA在体内的不同器官的生物分布,在注射药物后3h处死裸鼠,取出并分离器官,用生理盐水彻底冲洗后干净后进行体外组织分布荧光成像分析。 3.2.3磁共振靶向对比剂PA-TEMPO-FI-FA在肿瘤裸鼠体内的MRI研究：实验时,用0.3%戊巴比妥钠对裸鼠进行腹腔内注射麻醉,麻醉剂量约为0.3-0.5mL(裸鼠体重25-30克),然后固定裸鼠,采用仰卧位成像,用GE3.0T超导高场MR扫描仪,老鼠用动物线圈,SE序列T1WI横断面和冠状面扫描。MRI扫描参数为：SE序列、T1WI,TR=540ms,TE=10.7ms,层厚3mm(冠状面),FOV=12×12mm,矩阵=320X224。在完成平扫后,用1.0ml注射器经鼠尾静脉注入制备的靶向对比齐(?)PA-TEMPO-FI-FA溶液(PBS为溶剂),造影剂的浓度全部为5mM,每只小鼠药量约为2.5nmol,注射0.5ml；注射成功后,追加麻药,再次将裸鼠与平扫相同体外位固定于扫描器中,行各时间点扫描。观察模型注射前及注射后2h点瘤体T1WI信号值变化情况。实验动物数据依次从PACS工作站中转移到处理电脑,并使用MATLAB软件(The Math-Works, Natick, MA,USA)对数据进行处理,采用Microsoft VisualC++编辑图像处理程序并应用于MATLAB软件中。感兴趣区通过描绘T1WI上每个层面的肿瘤轮廓覆盖整个肿瘤,应用软件对包含肿瘤的图像进行整合计算获得每个像素点对应的像素信号值。以肿瘤增强前的像素分布为基线建立肿瘤平均信号值和标准差,各时间点的图像都经过相同的数据处理过程,高于基线平均信号值标准差以上的像素点,我们认为是肿瘤强化部分,由此依次处理实验动物(n=5),最后应用SPSS20.0统计软件包,采用配对样本t检验(Paired-Samples T Test)比较实验裸鼠肿瘤组织平扫及注射PA-TEMPO-FI-FA造影剂2小时后信号强度改变是否有显著性差异。P0.05则认为有显著性差异。 3.2.4荧光免疫组织化学 MR扫描结束后即行颈椎脱臼法处死裸鼠,并快速取其肿瘤组织,固定,包埋,并行冰冻切片观察肿瘤组织内荧光显像。 3.2.5正常裸鼠对PA-TEMPO-FI-FA造影剂急性毒性试验正常裸鼠分为对照组和实验组,分别注射生理盐水和PA-TEMPO-FI-FA溶液后观察裸鼠一般状况,2天后处死并进行HE染色组织器官病理学检查。 3.3结果 3.3.1新型有机自由基磁共振造影剂细胞毒性的评估 MTT法测定细胞存活率结果表明。在浓度小于5mM时,在误差范围内PA-TEMPO、PA-TEMPO-FI和PA-TEMPO-FI-FA三种药物的细胞毒性相当,三种造影剂作用下细胞存活均在80%以上；但随着培养液中药物浓度的增加,两组Hela细胞生存率均有下降的趋势。PA-TEMPO-FI-FA组药物的细胞毒性较PA-TEMPO、PA-TEMPO-FI组低；即使是高浓度组(10mM),细胞生存率也在80%左右,其毒性明显低于PA-TEMPO。这表明PA-TEMPO-FI-FA有良好的生物安全性。三种药物对细胞毒性影响的差异有显著统计学意义(P0.05)。 3.3.2新型有机自由基磁共振造影剂T1信号强度与T1弛豫率的评估随之PA-TEMPO、PA-TEMPO-FI及PA-TEMPO-FI-FA浓度增加,T1信号值逐渐增强,相同浓度下,PA-TEMPO较PA-TEMPO-FI及PA-TEMPO-FI-FA组的信号值稍高。从T1加权图像及相应伪彩图上也可以看出,浓度越高,信号越强,并PA-TEMPO组比PA-TEMPO-FI及PA-TEMPO-FI-FA组的强化效果稍明显。稀释在PBS中的不同浓度PA-TEMPO、PA-TEMPO-FI和PA-TEMPO-FI-FA的T1mapping T1值测定结果显示：随着药物浓度的增加,三组药物的T1值都逐渐下降。以药物浓度(mM)为横坐标(X),相应1/T1为纵坐标(Y)作图,在1-10mM浓度范围内三种药物的线性关系良好。直线方程的斜率为T1弛豫率,分别为0.27mmol-1s-1、0.23mmol-1s-1及0.20mmol-1s-1。PA-TEMPO、 PA-TEMPO-FI的弛豫率稍高于PA-TEMPO-FI-FA,PA-TEMPO的弛豫率最高。 3.3.3新型有机自由基磁共振造影剂细胞摄取评估荧光显微镜观察体外Hela细胞摄取,用DAPI进行核染：空白组与含PA-TEMPO-FI及PA-TEMPO-FI-FA溶液Hela细胞孵化2h后爬片荧光显微镜观察；与空白组相比,对照组与实验组Hela(?)细胞内可见不同程度的绿色荧光在蓝染的细胞核周围,实验组(PA-TEMPO-FI-FA)较对照组(PA-TEMPO-FI)能被Hela细胞明显摄取更多,说明合成的叶酸修饰后,配体受体特异性结合有利于PA-TEMPO-FI-FA被肿瘤细胞高效摄取,也验证了PA-TEMPO-FI-FA(?)能有效地靶向叶酸受体阳性的肿瘤细胞。 3.3.4新型有机自由基磁共振造影剂体外细胞MRI评估体外Hela细胞摄取后MRI成像进一步验证PA-TEMPO-FI-FA的应用潜力。空白组与含不同浓度PA-TEMPO-FI及PA-TEMPO-FI-FA溶液Hela细胞孵化4h后MRI成像观察；与空白组相比,对照组和实验组Hela细胞用0.1%琼脂糖混匀后MRI T1加权成像,对照组和实验组较空白组均有信号强度改变,但可见相同浓度条件下,实验组(PA-TEMPO-FI-FA)较对照组(PA-TEMPO-FI)信号强度明显增加,并随着浓度增强(0-5mM),信号增强显著。实验结果表明靶向PA-TEMPO-FI-FA能被细胞摄取,并在体外细胞MRI成像中检测到信号的增强。 3.3.5靶向磁共振造影剂PA-TEMPO-FI-FA在肿瘤裸鼠中的活体荧光与组织分布评价；尾静脉注射PA-TEMPO-FI-FA溶液后不同时间点进行活体荧光成像。注射30min后,可见裸鼠体内有丰富的荧光分布,范围较广,而肿瘤区域尚未见明显荧光显像；到1h时,肿瘤区域可见与其他部位相同荧光强度分布；1.5h时,可见肿瘤区域与腹部区域明显荧光聚集；2h时,可见药物在肿瘤区域明显特异性荧光增强；2.5h后仍可见裸鼠肿瘤区域荧光富集,但较2h稍减弱,其他区域荧光基本消失。从结果可以看出我们合成的叶酸靶向有机自由基PA-TEMPO-FI-FA造影剂的特异性,能有效实现药物在叶酸过表达的肿瘤内较丰富及长效的聚集。 3.3.6新型有机自由基磁共振对比剂PA-TEMPO-FI-FA在肿瘤裸鼠中的MRI成像评估注射前及尾静脉注射PA-TEMPO-FI-FA溶液后不同时间点进行活体MRI成像。肿瘤区域可以看到信号逐渐增强,峰值出现在2h。数据处理后进行统计学分析,结果显示裸鼠皮下移植型宫颈癌肿瘤组织平扫及增强后2h的信号增强差异有显著统计学意义(P0.05)。体内MRI结果表明,新型有机自由基磁共振造影剂PA-TEMPO-FI-FA能有效靶向叶酸过表达的肿瘤,实现肿瘤MRI信号显著增强效应。 3.3.7裸鼠肿瘤组织免疫荧光组织化学评估冰冻切片荧光显微镜下可见肿瘤细胞核蓝染,周围可见丰富的绿色荧光围绕,证明绿色荧光素FI标记的靶向有机自由基造影剂到达肿瘤部位,并能有效地在肿瘤组织中富集。 3.3.8正常裸鼠对PA-TEMPO-FI-FA的急性毒性试验评估对照组与实验组裸鼠处死前两天内一般状况良好；HE染色病理组织检查对照组与实验组脑、心、肺、肝、脾、肾六个器官,结果证明对照组与实验组皆未显示明显的病变区域,未见有明显的脑、心、肺、肝、脾、肾毒性。结论基于顺磁性有机自由基TEMPO的MRI T1弛豫特性,应用我们合成的新型有机自由基靶向MR比剂——PA-TEMPO-FI-FA可初步实现动物肿瘤组织的主动靶向性MR显像。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R445.2

【参考文献】