当归多糖对辐射损伤小鼠骨髓单个核细胞氧化损伤及凋亡影响的研究

发布时间：2016-12-18 05:22

  本文关键词：当归多糖对辐射损伤小鼠骨髓单个核细胞氧化损伤及凋亡影响的研究，由笔耕文化传播整理发布。

《重庆医科大学》 2012年

当归多糖对辐射损伤小鼠骨髓单个核细胞氧化损伤及凋亡影响的研究

何晓莉  

【摘要】：电离辐射作用于机体可诱发大量自由基产生，而自由基作用于DNA、RNA等生物大分子，可致使其结构改变和生物活性丧失，从而造成机体发生氧化损伤。超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）是一种普遍存在于微生物及动植物中的金属酶，它可以催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，清除自由基，从而保护受损细胞，并对机体的氧化及抗氧化平衡起着非常重要的作用。丙二醛(maleicdialdehyde，MDA)是过氧化脂质的降解产物，通过检测MDA的含量可以判断脂质过氧化反应的程度，从而间接反应细胞损伤情况。 细胞凋亡(apoptosis，AP)是指细胞在受到某些因素刺激或接受某种信号后的一种主动的，由大量凋亡相关基因相互作用的细胞消亡的过程。它是一个多因素参与的、复杂的生物学过程。电离辐射所致细胞凋亡的信号通路主要有：依赖于DNA损伤、依赖于胞质电离损伤、依赖于质膜损伤和SAPK／JNK4种。P53、Bc1-2、Caspase-3在电离辐射诱导细胞凋亡的过程中发挥着重要作用。电离辐射诱发细胞凋亡是通过P53依赖的方式来诱导死亡受体Fas及其配体FasL的表达。Bc1-2是细胞凋亡相关基因研究中最被关注的蛋白质之一，在辐射损伤中其主要作用是抑制辐射诱导的细胞凋亡。Caspase-3是细胞凋亡过程中极其重要的执行分子之一，它能够剪切细胞凋亡过程中的许多非常关键地蛋白，其激活通常需要从无活性的全长Caspase-3(35KD)的Asp28和Ser29之间及Asp175和Ser176之间进行剪切，产生有活性的亚基（17KD和12KD），其激活常被认为是细胞凋亡的一个非常重要的指标。 骨髓对电离辐射高度敏感。骨髓单个核细胞(bonemarrowmononuclearcell，BMNC）主要包括淋巴细胞和单核细胞。辐射损伤可使BMNC数量减少，细胞周期阻滞，细胞发生氧化损伤及凋亡等。 当归多糖（angelicapolysaccharides，APS）是传统补血活血中药——当归的主要活性成分之一。研究表明：它具有影响造血系统、抗辐射、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒及调节免疫等功能。目前，APS抗辐射的具体机制并不十分明确。本实验是在建立C57BL/6小鼠急性放射损伤实验动物模型的基础上，研究APS对急性放射损伤小鼠BMNC氧化损伤及细胞凋亡的影响，旨在探讨APS抗辐射的分子机制，为辐射保护剂的开发提供理论依据。 目的：研究APS对急性放射损伤小鼠BMNC氧化损伤、增殖能力、细胞凋亡率以及凋亡相关蛋白表达的影响，进而了解APS抗辐射的分子机制。 方法： 1.C57BL/6小鼠随机分为10组，，正常组(不作任何处理)；生理盐水（normalsaline，NS）组、2mg/kgAPS组和8mg/kgAPS组，后3组根据时间点分别再分为第1d、3d、7d组，共计9组。此9组小鼠采用直线加速器X线全身均匀照射，总剂量为4.0Gy，时间1.25min，吸收剂量率3.76Gy/min，焦点距鼠100cm，面积约25×25cm~2。照射后于3h内腹腔分别注射NS、2mg/kgAPS和8mg/kgAPS，连续注射7d（每天注射一次，注射前称重，根据小鼠体重分别计算出相应注射体积），于照射后第1、3、7d处死小鼠，常规方法提取其BMNC。 2.比色法检测各组小鼠BMNC的SOD活性及MDA含量。 3.流式细胞仪（flowcytometry，FCM）检测各组小鼠BMNC细胞周期。 4.FCM检测各组小鼠BMNC凋亡率。 5.FCM检测各组小鼠BMNCBcl-2的表达率。 6.免疫细胞化学法和蛋白免疫印迹法（WesternBlot，WB）检测各组小鼠BMNCP53的表达。 7.WB检测各组小鼠BMNCCaspase-3的表达。 结果： 1.实验小鼠急性放射损伤模型的建立：造模成功后NS组小鼠表现为饮水量增加，进食量减少，偶有腹泻、血便；皮毛略显凌乱，易脱落；活动显迟缓，嗜睡，小鼠之间相互靠拢。各APS治疗组小鼠上述症状相对减轻。 2.APS对放射损伤后小鼠BMNCSOD活性及MDA含量的影响：照射后第1、3、7dNS组与正常组相比，BMNC的SOD活性显著降低、MDA含量明显升高（P0.05）；2mg/kgAPS组和NS组同一时间点比较，BMNCSOD活性增加，MDA含量降低，但差异均无显著性（P0.05）；8mg/kgAPS组较NS组同一时间点比较，BMNC的SOD活性显著增加（P0.05），但仍低于正常组，MDA含量显著降低（P0.05），但仍高于正常组。 3.APS对放射损伤后小鼠BMNC周期（G_0/G_1期）改变的影响：照射后第1、3、7dNS组BMNC停滞于G_0/G_1期，与正常组比较差异有统计学意义(P0.05)。2mg/kgAPS组与NS组(1、3d)比较，其G_0/G_1期比例有所下降，但差异无显著性（P0.05）；2mg/kgAPS组(7d)及8mg/kgAPS组与NS组同一时间点比较，G0/G1期比例显著性降低(P0.05)，但仍高于正常组。 4.APS对放射损伤后小鼠BMNC凋亡率的影响：照射后第1、3、7dNS组BMNC的凋亡率均较正常组显著增高（P0.05）；2mg/kgAPS组BMNC凋亡率较NS组在照射后第1d、3d有所下降，但差异不显著(P0.05)；2mg/kgAPS组(7d)及8mg/kgAPS组与NS组同一时间点比较，细胞凋亡率显著下降（P0.05），但仍高于正常组。 5.APS对放射损伤后小鼠BMNCBcl-2蛋白表达率的影响：照射后第1、3、7dNS组BMNC的Bcl-2表达率均较正常组显著降低（P0.05）；2mg/kgAPS组BMNCBcl-2表达率较NS组在照射后第1d、3d有所升高，但差异不显著(P0.05)；2mg/kgAPS组(7d)及8mg/kgAPS组与NS组同一时间点比较，Bcl-2表达率升高显著（P0.05），但仍低于正常组。 6.APS对放射损伤后小鼠BMNCP53蛋白表达的影响：免疫细胞化学结果显示：正常组小鼠BMNC不表达P53，NS组、2mg/kgAPS、8mg/kgAPS组P53的表达率明显升高，但上述三组各时间点间表达均无显著差异。WB结果显示：照射后第1、3、7dNS组BMNC的P53均较正常组显著增高（P0.05）；2mg/kgAPS组与NS组同一时间点相比，P53蛋白的表达有所降低，但差异无统计学意义（P0.05）；8mg/kgAPS组与NS组同一时间点相比，P53蛋白的表达降低明显（P0.05）。 7.APS对放射损伤后小鼠BMNCCaspase-3蛋白表达水平的影响：正常组的Caspase-3未被激活，只表达全长片段（35KD），不表达激活片段（12+17KD）。照射后NS组各时间点与正常组比较，Caspase-3的全长片段表达较显著降低、激活片段表达显著增加（P0.05）；2mg/kgAPS组与NS组同一时间点相比，全长片段表达有所增加，激活片段表达有所降低，但差异无统计学意义（P0.05）；8mg/kgAPS各组与NS组同一时间点相比，全长片段表达增加、激活片段表达降低（P0.05）。 结论：APS不仅能提高辐射损伤小鼠BMNC的SOD活性，降低其MDA含量；它还能减轻细胞周期阻滞、减少细胞凋亡率、降低P53总蛋白及Caspase-3激活片段表达、升高Bcl-2表达率，从而对辐射损伤小鼠具有保护作用。8mg/kgAPS组与2mg/kgAPS组相比，抗辐射效果更明显。其机制可能是：APS通过提高SOD活性，减少MDA含量，导致辐射损伤后BMNC自由基含量减少，从而减轻DNA损伤；同时APS可降低P53表达，减少细胞周期阻滞，上调Bcl-2表达水平，减少Caspase-3激活，最终减轻细胞凋亡。

【关键词】：
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R285.5;R818
【目录】：

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本文编号：218200