一、利用磁共振技术对移植到心脏内的铁磁性标记的骨髓间充质干细胞进行在体示踪的实验研究二、冠状动脉内骨髓间充质干细胞移植

发布时间：2020-04-09 01:36

【摘要】： 第一部分：利用磁共振技术对移植到心脏内的铁磁性标记的骨髓间充质干细胞进行在体示踪的实验研究目的：细胞移植是目前缺血性心脏病治疗研究的热点之一。目前大多动物实验中对于细胞移植到体内之后的存留、分化、迁移等的研究需要通过病理组织切片进行。本实验的主要目的是寻找一种能够对移植细胞进行在体示踪的手段，以能够对移植细胞在体内的存留、分布、迁移进行在体评价。方法：实验方法分为体内和体外实验两部分，针对一种全新的细胞标记试剂对细胞的标记效率、对细胞的生长、分化、迁移的影响以及标记后的细胞直接心肌内注射移植和经冠状动脉内注射移植后的在体显影和在体显影维持时间进行了研究。体外实验部分：从中华小型猪髂骨处抽取骨髓，体外培养扩增骨髓间充质干细胞并进行鉴定。将铁磁性造影剂和骨髓间充质干细胞共同孵育培养36-48小时。使用普鲁士蓝染色标记后的细胞评价铁离子标记的效率；使用MTT比色实验评价标记对细胞生长能力的影响；使用台盼蓝染色检验标记后细胞的活性；用Costar Transwell24孔培养板进行细胞对化学因子的迁移实验，评价细胞标记后的迁移能力是否受影响；使用细胞分化诱导液评价细胞标记后的分化能力。体内实验部分： 1．心肌内直接注射移植：结扎冠状动脉前降支建立猪的心肌梗死模型(n=15)，模型建立后10天将铁离子标记的自体骨髓间质细胞(1×10~7细胞／只动物)通过心肌内直接注射方法移植到梗死或正常心肌组织内，分别在细胞移植后当天、1周、2周、3周、4周进行常规心脏磁共振检查，对移植细胞进行在体显像。另外5只动物作为对照组，，移植未标记的骨髓间质细胞。分别在细胞移植后不同时间取才动物心脏标本，切片进行普鲁士蓝染色观察细胞在心肌内的分布和形态。 2．经冠状动脉内注射移植：在这部分实验中我们采用猪的缺血再灌注模型进行研究，将冠状动脉阻断90分钟后开放，通过导管将骨髓间充质干细胞直接注射到梗死相关的冠状动脉内。实验组6只，注射铁离子标记的细胞，对照组3只注射未经标记的骨髓问充质干细胞。分别在细胞移植后当天、1周、3周进行磁共振检查和病理组织取材。在组织取材时同时取肺脏、肝脏、脾脏、肾脏组织进行切片，观察细胞经冠状动脉内注射移植后在全身非靶器官的分布情况。结果体外实验部分：铁离子转染后，骨髓间质细胞普鲁士蓝染色发现在细胞浆内有蓝色颗粒存在，细胞染色阳性率为95％以上；MTT实验表明不同浓度的铁磁性标记物对细胞增殖没有明显的影响；台盼蓝染色显示标记后98％的细胞拒染台盼蓝；铁磁性标记物对rhSDF-1和VEGF诱导的细胞迁移能力没有影响；铁离子标记后骨髓间充质干细胞向成脂肪细胞、成骨细胞的分化能力不受影响。体内实验部分： 1．心肌内直接注射：铁离子标记的骨髓间充质干细胞直接注射到心肌组织内后，注射点均可通过磁共振显像，表现为明显的低信号灶影或信号缺失影像。动态观察显示细胞显像可以持续到移植后4周，信号影呈动态变化，强度减低，范围扩大。病理学检查可以见移植细胞呈普鲁士蓝染色阳性，并与磁共振影像学的显影有很好的一致性。移植后早期细胞在心肌内聚集成“岛状”，在移植后1周存活的细胞在心肌内散在分布，并且按相同的方向排列。普鲁士蓝染的颗粒均在存活的细胞胞浆内，未见单独存在的普鲁士蓝染色颗粒在梗死的心肌组织内存在。对照组未发现注射点显像和普鲁士蓝染色阳性细胞。 2．冠状动脉内注射：铁离子标记的骨髓间充质干细胞经冠状动脉内注射后，可在磁共振检查中显影，移植细胞在相关心肌组织区域内呈散在的点状分布，表现为低密度信号影像，大小不一。病理组织学检查中可见胞浆蓝染的细胞在左心室前壁、室间隔、右心室前壁的心肌组织内分布，与磁共振检查影像有良好的一致性。移植后当时细胞较均匀的分布在心肌组织内，1周后细胞散在分布。在移植1周后的肺脏、脾脏、肾脏内均可见大量的细胞存在，肝脏组织内少见移植细胞分布。结论：这种临床应用的超顺磁性氧化铁微颗粒磁共振造影剂，可以有效地标记骨髓间质细胞，不影响细胞形态、生长、增殖、分化，不影响细胞对化学趋化因子的迁移能力。利用心脏磁共振技术可以对心肌内注射的以及冠状动脉内注射的铁离子标记的移植细胞进行在体示踪。铁离子标记方法结合磁共振技术为移植细胞的在体示踪和观察细胞的存留、迁移提供了良好的手段。第二部分：经冠状动脉内骨髓间充质细胞移植后细胞的存留、分布、迁移及其机制的初步研究 Retention，Distribution，Migration of the Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells after Transcoronary Infusion and the Study of Migratory Mechanism of transplanted MSCs 实验目的：冠状动脉内细胞移植是目前临床细胞移植的主要途径，冠状动脉内细胞移植后移植细胞的存留、分布和迁移是关系细胞移植治疗效果的重要因素之一。本实验主要研究经冠状动脉内注射骨髓间充质干细胞后移植细胞在心脏内的存留、分布和迁移情况以及在全身重要脏器内的分布，同时对移植细胞向心肌梗死区域迁移的机制进行了初步研究。实验方法：体外实验部分： 1．骨髓间充质干细胞经冠状动脉内注射后的存留比例 Lewis大鼠左侧开胸结扎左冠状动脉，制作心肌梗死模型。1周后取心脏建立离体心脏灌注模型。将Dil标记的骨髓间充质干细胞悬液注入主动脉根部，同时收集右心房回流的液体，离心后通过流式细胞仪计数细胞数量。观察是否有细胞经冠状静脉回流及数量比例。分别在细胞移植之前、细胞移植后5分钟、10分钟、20分钟、30分钟记录左室收缩压、左室舒张压、左室±dp／dt、心率的变化，评价其安全性。 2．细胞的趋化实验体外实验用Costar Transwell24孔培养板做细胞对于rh SDF-1、不同时期心肌梗死区域组织提取液的趋化研究以及间充质干细胞经G蛋白阻滞剂PTx处理后的对其迁移能力的影响。体内实验部分： 1．骨髓间充质干细胞经冠状动脉内注射后在心脏内及重要脏器分布：取心梗后1周的大鼠，经左心室-主动脉途径将细胞悬液注射到临时阻断的主动脉根部，分别在移植后1小时、24小时、1周、4周取材观察细胞在心脏内的位置及细胞的迁移情况。 2．梗死组织内SDF-1α的表达及细胞的趋化实验在心肌梗死后2小时、8小时、24小时、48小时、1周、2周、3周、6周取材心肌梗死区域心肌组织，RT-PCR的手段测量局部组织中SDF-1αRNA的基因表达。利用Costar Transwell细胞双层培养板评价骨髓间充质细胞向rh-SDF-1的迁移，以及骨髓间充质干细胞向不同时间的心肌梗死组织提取液的迁移能力，并评价细胞经G-蛋白受体阻滞剂处理后向更斯心肌组织提取液迁移的变化。实验结果：经冠状动脉内注射髓间充质干细胞后早期90％以上的细胞在心肌组织内存留。经主动脉根部将细胞注射到冠状动脉内后对左室收缩压、左室舒张压、左室±dp／dt、心率的变化没有明显影响。在体内实验中发现细胞移植后早期大部分细胞分布在心外膜下心肌组织内，在心内膜下组织内较少细胞分布，而且大部分细胞在正常心肌组织内，只有少量在心梗区域。而在细胞移植后1—4周存活的细胞多在心肌梗死及交界区组织内，在正常组织内很少有移植细胞存在。在心肌梗死后24小时心梗局部组织心肌SDF-1的基因表达水平明显升高，48小时达到峰值水平，在心梗后2周仍维持在较高水平，3-6周时恢复正常水平。MSCs对于SDF-1有明显的剂量依赖性趋化作用，心肌梗死后的提取液对于细胞的趋化作用与SDF-1在心肌梗死区域的表达水平呈一致的变化趋势，经PTx处理后的细胞向心肌梗死提取液的趋化能力明显降低。实验结论：、经冠状动脉内途径进行细胞移植是安全的可靠的，冠状动脉内注射进行细胞移植后大部分细胞在冠状动脉内存留，并有向心肌梗死区域迁移的趋势。心肌梗死后局部组织中SDF-1的表达迅速升高并维持一定时间，可能是细胞迁移的主要因子，骨髓间充质干细胞向梗死心肌组织迁移可能主要是G-蛋白介导的。
【学位授予单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R445.2;R542.22

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