携siRNA真核表达载体靶向脂质微泡的构建与表征

发布时间：2020-05-07 05:54

【摘要】：目的：构建沉默人survivin基因的siRNA真核表达载体，采用聚乙烯亚胺胆固醇衍生物将载体连接到脂质微泡，并对微泡进行靶向修饰，使其与乳腺癌细胞膜表面HER-2抗原特异性结合，探索一种新型的乳腺癌RNA干扰治疗基因转染工具。方法： 1.采用免疫荧光法检测乳腺癌细胞膜表面HER-2抗原；采用机械振荡法制备脂质微泡，生物素-亲和素桥接法将靶向乳腺癌细胞膜表面抗原HER-2抗体赫赛汀连接到脂质微泡上，观察微泡的形态、密度、粒径及分布范围，并考察其与表达HER-2的乳腺癌细胞SK-BR-3特异性结合的能力。 2.设计合成靶向人survivin基因的发夹结构的siRNA模板，克隆至真核表达载体pGPU6/GFP/Neo，构建重组质粒pGPU6/GFP/Neo-survivin，转化感受态细胞TOP10菌株，扩增并提取质粒，对重组质粒进行酶切鉴定、序列测定。 3.以聚乙烯亚胺、胆固醇甲酰氯为原料合成阳离子脂质PEI-Chol，琼脂糖凝胶电泳阻滞试验检测不同N/P比对PEI-Chol结合质粒DNA能力及PEI-Chol/DNA复合物抗核酸酶DNase I酶解的能力。 4.采用反相蒸发-机械振荡法制备载siRNA真核表达载体的脂质微泡，生物素-亲和素桥接法将赫赛汀抗体偶联到脂质微泡，构建携siRNA真核表达载体的靶向微泡，显微镜观察微泡的形态、密度、粒径及分布范围，观察载基因靶向微泡与乳腺癌细胞SK-BR-3的结合能力。结果： 1.免疫荧光结果显示，SK-BR-3细胞可与赫赛汀结合发出绿色荧光，而MDA-MB-231未见荧光；采用机械振荡法制备的脂质微泡分散良好，粒径分布较均匀，平均粒径为(3.1±0.7)μm，密度为1.6×10~8/ml，生物素-亲和素桥接法成功将赫赛汀偶联到脂质微泡；靶向脂质微泡微泡特异性结合到表达HER-2的SK-BR-3细胞。 2.靶向survivin的siRNA成功克隆到pGPU6/GFP/Neo质粒载体，重组载体可被限制性内切酶BamH I切开，而不能被Bbs I切开，基因测序证实为survivinsiRNA的真核表达载体。 3.当N/P为3.75时，质粒DNA完全被PEI-Chol及PEI包裹；当N／P比降为1.88时，泳道上可见游离DNA条带荧光，且PEI-Chol对质粒DNA的包裹能力高于PEI。PEI-Chol包裹质粒DNA可保护DNA免受核酸酶DNase I降解。 4.反相蒸发-机械振荡法制备的载siRNA真核表达载体的脂质微泡平均粒径为(3.8±0.9)μm，密度为1.3×10~8/ml，与赫赛汀抗体偶联后可特异性结合到SK-BR-3细胞。结论：本研究成功构建了沉默人survivin基因的siRNA真核表达载体，通过聚乙烯亚胺胆固醇衍生物结合到脂质微泡，并对载基因微泡进行靶向修饰，可特异性结合到表达HER-2的人乳腺癌细胞，，为乳腺癌RNA干扰治疗提供一种新型的基因转移工具。
【图文】：

细胞系,光学显微镜

图 1 SK-BR-3 细胞系光学显微镜图（×200）Fig.1 SK-BR-3 cell line (×200)图 2 MDA-MB-231 细胞系光学显微镜图（×200）Fig.2 MDA-MB-231 cell line (×200)

细胞系,光学显微镜,化学鉴定,微镜

10图 2 MDA-MB-231 细胞系光学显微镜图（×200）Fig.2 MDA-MB-231 cell line (×200)胞化学鉴定微镜下 SK-BR-3 细胞表面可见绿色荧光（图 3），PBS 未见荧光（图 4）。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R445.1;R737.9

【参考文献】