超声辐照下携载AR siRNA的纳米级微泡抑制AIPC生长的实验研究

发布时间：2020-05-17 17:22

【摘要】：背景前列腺癌是男性高发的恶性肿瘤之一，常规去激素治疗后多数会在12-18个月内发展成为雄激素非依赖性前列腺癌（AIPC），目前临床上对于AIPC缺乏有效的治疗方法。雄激素受体（AR）在AIPC的发生发展中起到关键作用，利用RNA干扰技术，阻断雄激素受体的表达可以起到治疗AIPC的作用并已经在体外实验中取得良好的效果。但同其他肿瘤的基因治疗一样，前列腺癌临床或体内基因治疗效果不尽理想，存在基因转染率低，治疗基因难以聚集到靶组织内等问题，其主要原因是缺乏一种安全、可控、靶向的基因递送载体。超声微泡的出现为解决基因治疗这一瓶颈问题带来了希望，超声微泡介导的靶向基因治疗方法既可增强基因在肿瘤细胞内的转染和表达情况,又能提高基因治疗的靶向性,减少全身不良反应，与其它方法相比，具有安全、有效、靶向性强等优点，是一种很有前景的临床肿瘤治疗技术。随着纳米医学和超声造影剂的飞速发展，纳米级超声微泡成为超声造影剂的发展趋势。与常规微米级微泡相比，纳米级微泡具有较强的穿透力，稳定性高，包载率及携载基因转染效率高等特点，在肿瘤的基因治疗和靶向显影方面逐步体现出其巨大的优势。研究目的基于以上研究进展，本研究拟在筛选出最有效的AR siRNA序列基础之上，利用纳米级超声微泡作为基因递送载体，制备携载AR siRNA的纳米级超声微泡，检测其体内外特性，并在超声辐照下转染前列腺癌细胞。在细胞分子生物学水平评价携载AR siRNA纳米级微泡抑制AR基因的表达及前列腺癌细胞生长的效果。为超声辐照下纳米级微泡作为体内基因载体治疗AIPC肿瘤提供实验依据和研究基础。方法 1．设计并合成三种靶向于雄激素受体的siRNA，利用当今广泛应用的脂质体转染法，以不同浓度转染AIPC细胞C4-2，确定最佳转染浓度。RT-PCR和Western blot分别检测转染后AR mRNA表达水平和AR蛋白表达水平。CCK-8分析绘制细胞生长曲线，观察C4-2细胞生长活性并筛选出抑制效果最佳的siRNA靶序列。 2．通过机械振荡及低速离心法制备空白纳米级微泡，利用多聚赖氨酸法制备携载AR siRNA的纳米级超声微泡，检测两者微泡粒径，表面电位及微泡与siRNA结合情况。在裸鼠前列腺癌移植瘤进行造影显像研究，并与常规微米级微泡（SonoVue）对比造影效果。 3．超声辐照下携载AR siRNA的纳米级超声微泡转染LNCap、C4-2和PC-3三种前列腺癌细胞，流式细胞仪测定转染率，筛选最佳超声辐照条件和微泡浓度范围。RT-PCR和Weston blot检测转染后AR mRNA和AR蛋白表达水平，CCK-8分析绘制细胞生长曲线，评价AR siRNA沉默靶基因对前列腺癌细胞生长的抑制效果。结果 1．以100nM最佳转染浓度转染C4-2细胞后，AR的mRNA和蛋白表达水平显著下降，细胞增殖活性显著降低，并根据抑制效果筛选出最有效靶序列。 2．荧光显微镜下观察纳米级微泡与AR siRNA紧密结合，并可以通过提高ARsiRNA浓度来增加载基因量。粒径检测仪测量平均粒径（608.2±13.3）nm，，Zeta电位（-29.9±6.5）mV。与“SonoVue”比较，纳米级微泡体内显影时间较前者显著延长（P0.05），肿瘤中心乏血管区域显影效果较好。 3．超声辐照下携载AR siRNA的纳米级微泡转染前列腺癌细胞，获得最高细胞转染率的体外超声辐照条件为MI=1.2，辐照时长=2min，微泡量/细胞量=100:1（载基因量18.94×10-9nmol/个）。转染后24小时光镜观察C4-2和LNCap细胞的裸ARsiRNA+超声辐照组、裸ARsiRNA+空白纳米级微泡+超声辐照组和携载ARsiRNA的纳米级微泡+超声辐照组均出现细胞形态变化，以48小时变化明显，主要表现为细胞轮廓模糊，形态萎缩，生长缓慢，而PC-3细胞形态变化不明显。RT-PCR和Western blot结果显示：上述三组C4-2和LNCap细胞的AR mRNA和AR蛋白表达分别受到不同程度的抑制，其中携载ARsiNA的纳米级微泡+超声辐照组的抑制作用最为明显。CCK8分析结果显示：C4-2和LNCap细胞的上述三组siRNA转染C4-2细胞后均可以达到较明显的生长抑制效果，其中C4-2细胞的携ARsiRNA纳米级微泡+超声辐照组的生长抑制率最高，为64.7%，与其余各组或PC-3转染各组比较差异具有统计学意义（P0.05）。结论 1.利用RNAi技术沉默AR基因，能够抑制前列腺癌C4-2细胞的生长活性。 2.利用多聚赖氨酸法制备的携载AR siRNA的纳米级微泡，微泡与siRNA结合较为牢固，载基因量高。在体内外特性的检测中，纳米级微泡在稳定性及成像特性方面优于微米级微泡。 3.利用纳米级微泡作为载体，在超声辐照下将AR siRNA转染至前列腺癌细胞，可以有效的沉默AR基因，抑制LNCap、C4-2前列腺癌细胞的生长。
【图文】：

琼脂糖凝胶电泳,转染,组图

M:分子量标准；1:AR siRNAⅠ;2:AR siRNAⅡ;3:AR siRNAⅢ;4:siRNA-NC图 1-1 合成的 AR siRNA 2%琼脂糖凝胶电泳结果转染组阴性对照组图 1-2：AR siRNA 转染 C4-2 后细胞形态变化（200×）

转染,组图,表达水平

20转染组阴性对照组图 1-2：AR siRNA 转染 C4-2 后细胞形态变化（200×）子量标准;1:AR siRNA I;2:AR siRNA Ⅱ;3:AR siRNA Ⅲ;4:阴性对照;5:空白对照;6:无关图 1-3 RT-PCR 检测 siRNA 转染后 AR mRNA 表达水平
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R445.1;R737.25

【参考文献】