X-射线照射后A549细胞释放的exosome对同源细胞及巨噬细胞功能的影响

发布时间：2017-03-25 15:01

  本文关键词：X-射线照射后A549细胞释放的exosome对同源细胞及巨噬细胞功能的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:放疗是治疗肿瘤的有效方法之一,但临床上发现放疗后循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)数目增加,并通过循环肿瘤细胞造成肿瘤的复发和转移。目前认为肿瘤细胞分泌的外泌体(Tumor Derived Exosome,TD-exosomes)可参与并促进肿瘤的发生、发展,但放疗后残存肿瘤细胞分泌的外泌体的功能是否发生改变,即对肿瘤细胞及基质细胞的作用还鲜有报道。本实验采用A549细胞释放的exosome(A549/exo)和X-射线照射A549细胞株后提取的exosomes(irr-A549/exo),观察了其对同源细胞(即A549细胞)增殖、迁移及巨噬细胞Thp-1产生炎症因子的影响,为放疗导致的肿瘤复发和迁移提供实验数据。方法:1不同剂量X-射线照射对A549细胞增殖及凋亡的影响体外培养A549细胞株,采用X照射直线加速器进行照射,剂量分别为10Gy、20Gy及30Gy,对照组细胞不进行照射。然后将X射线处理后的细胞分别培养在96孔或6孔细胞培养板,继续培养24h、48h、72h,MTS方法观察A549细胞增殖;6孔板的细胞,在继续培养24h后,收集细胞,部分细胞采用75%乙醇固定,流式细胞仪分析细胞周期;另外部分细胞采用Annexin V/PE及7AAD进行标记,流式细胞仪测定细胞凋亡率。2 exosomes的制备及电镜观察收集体外培养的A549及经X射线照射72h后A549细胞的培养上清,差速离心法分离提取exosomes:2000×g,10min;10,000×g,1h;然后将上清超高速110,000×g离心16 h,以少量PBS重悬所得沉淀。最后用磷钨酸负染exosomes并在透射电镜下观察exosomes的形态,并以Nanodrop进行定量。3 A549细胞经X-射线照射后分泌的exosomes(irr-A549/exo)对同源A549细胞增殖及迁移的影响MTS实验、Transwell细胞迁移实验、划痕试验分别观察A549/exo或irr-a549/exo两种不同exosome对a549细胞增殖、迁移能力的影响。4a549/exo或irr-a549/exo对thp-1产生炎症因子的影响人单核细胞thp-1经pma诱导48h,使其分化为巨噬细胞。以a549/exo或irr-a549/exo分别作用于巨噬细胞12h和24h,收集培养上清,cba检测细胞培养上清中细胞因子tnf、il-8、il-6、il-10、il-1β和tgf-β1的表达情况。5a549/exo或irr-a549/exo对thp-1信号分子表达的影响收集a549/exo或irr-a549/exo刺激12h及24h的thp-1细胞,采用westernblot检测nf-κbp65/p-p65及p105/p-p105、p38/p-p38、jnk/p-jnk的表达变化。结果:1a549细胞经不同剂量放射线照射后,生长均受到不同程度的抑制,其中30gy放射线剂量可使a549细胞在72h内的抑制率维持在50%左右;细胞凋亡率达20%以上;细胞周期阻滞在s期。2电镜观察到大小均一的、直径约为100nm大小的圆形或椭圆形囊泡。3a549/exo或irr-a549/exo对a549细胞的增殖均没有明显影响;但划痕实验显示,与空白对照相比,a549/exo可显著提高a549的迁移率(p0.05),irr-a549/exo促a549横向迁移的能力更显著,与空白组及a549/exo刺激组均有显著差异(p0.05,p0.01)。transwell试验也显示,无论将exosome置于transwell小室的下室,或用exosome处理a549细胞24h,再将该细胞加入transwell的上室,继续培养24h后,穿过微孔滤膜的细胞均增加(p0.01),且irr-a549/exosome促细胞迁移的能力明显高于a549/exo(p0.05)。4巨噬细胞thp-1经a549/exo或irr-a549/exo刺激后,培养上清中il-1、il-6、tnf-α及tgf-β的水平显著增加。5巨噬细胞thp-1经a549/exo或irr-a549/exo刺激后12h,westernblot检测到p-p38活性增加,且irr-a549/exo作用更明显(p0.05)。结论:1a549经剂量为30gy的x-射线照射后释放的exosome,显著促进a549细胞的迁移;2 A549经剂量为30Gy的X-射线照射后释放的exosome,可促进Thp-1细胞产生IL-1、IL-6、TNF-α及TGF-β;3 X-射线照射可促进A549释放的exosome活化p-38信号分子。
【关键词】：X-射线 肺癌细胞株A549 exosome Thp-1 CBA IL-1 IL-6 TNF-α TGF-β
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.55
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 英文缩写10-11
• 前言11-12
• 材料与方法12-21
• 结果21-23
• 附图23-28
• 讨论28-29
• 结论29
• 参考文献29-32
• 综述 肿瘤释放的外泌体影响肿瘤进展和转移32-41
• 参考文献36-41
• 致谢41-42
• 个人简历42

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