大鼠肝纤维化的MR功能成像及磁粒子标记BMSCs移植修复肝损伤的MR示踪实验研究

发布时间：2020-05-31 19:20

【摘要】： 第一篇MR功能成像对大鼠肝纤维化早期诊断、定量分析的实验研究肝脏弥漫性病变中,肝纤维化和早期肝硬化因形态学改变不明显而成为影像学早期诊断面临的难题,传统的以反映解剖结构的影像学方法对此类病变难于提供有价值的诊断信息。目前,临床上应用的非创性的肝纤维化诊断方法敏感性和特异性较差;肝组织活检被认为是诊断肝纤维化的“金标准”,但作为一种侵入性的诊断方法,其临床应用具有许多限度。肝纤维化的早期检测、早期干预有助于阻止病变的进一步发展。因此,迫切需要开发无创性、对慢性肝病出现肝纤维化能进行早期预测、病变程度评价的新的方法。本研究通过CCI4诱导建立大鼠肝纤维化模型,采用磁共振功能成像(弥散加权成像、波谱成像、灌注成像和肝细胞特异性对比剂应用)技术,并与病理组织学对照,对肝纤维化进展过程中,分子弥散、能量代谢、血流灌注和肝细胞功能等多因素病理生理改变进行动态、系统研究,国内外类似研究尚未见报道。本研究目的在于探讨肝纤维化的MR功能成像参数及最佳成像序列;分析不同程度、不同分期肝纤维化的MR功能成像表现,探索肝纤维化MR功能成像的量化诊断指标;评价MR功能成像在肝纤维化、早期肝硬化诊断中的价值。第一部分大鼠肝纤维化模型的建立 1.目的:采用SD大鼠皮下注射四氯化碳法,建立肝纤维化动物模型,为肝纤维化的MR功能成像和骨髓基质细胞肝移植MR示踪研究提供不同分期的肝纤维化动物模型。 2.方法: 实验组大鼠腹部皮下注射40%CCl4油溶液,剂量为3ml/kg体重,2次/周,首次剂量为5ml/kg体重;10%乙醇溶液作为唯一饮用水。对照组大鼠腹部皮下注射生理盐水,剂量及用法同实验组,纯净水作为饮用水。注药后第2周开始,每周随机抽取实验组大鼠4只、对照组大鼠1只,肝脏磁共振功能成像(DWI、MRS、PWI)后4小时内处死大鼠,肝脏取材行HE染色、Masson三色染色、网状纤维染色及透射电镜检查,光镜下判定肝纤维化分期。 3.结果: 模型组共有94只大鼠完成实验,死亡46只,死亡率33 %。模型组大鼠均出现不同程度的营养不良、慢性肝病症状。肝脏病理组织学检查见炎症细胞浸润,肝细胞坏死,胶原及网状纤维增生,肝窦毛细血管化等改变。对照组20只全部存活,无相应症状。肝纤维化病理分期:0期28只、1期19只、2期27只、3期25只、4期15只。 4.结论: 复合因素(CCl4+酒精)能成功地诱导大鼠肝纤维化,并且具有成模率高,造模周期短优点,并有较明显的阶段性变化;应用复合因素可建立不同病理分期的肝纤维化模型,为肝纤维化研究提供理想的实验模型。第二部分大鼠肝纤维化的MR弥散加权成像(DWI) 1.目的: 通过分析大鼠不同程度肝纤维化的DWI信号强度、ADC值和EADC值变化,以探讨应用非创性DWI检测方法对肝脏纤维化早期诊断、量化分析及其分期的价值。 2.方法: 第一部分在大鼠给药建立肝纤维化模型过程中,每周随机抽取模型组大鼠4只,对照组大鼠1只,进行MR弥散成像: SE-EPI序列,梯度因子b分别取:0s/mm2、300 s/mm2、600 s/mm2、800 s/mm2、1000 s/mm2。根据不同b值拟合得到ADC图、EADC图,测定不同b值弥散成像的信号强度,计算ADC值和EADC值,并与病理分期对照。 3.结果: (1)实验组大鼠随着肝纤维化分期的增加,DWI信号强度呈增加趋势,各叶纤维化进展不近相同,表现为DWI信号强度不均匀。(2)b=300、600、800、1000 s/mm2时,SNR分别为(x±S):36.30±23.25、28.11±12.48、25.71±11.82和15.23±6.54,图像质量呈下降趋势,b=600、800 s/mm2时优于b=1000 s/mm2(P㩳0.05)。(3)ADC值分析:对照组与1期、2期、3期、4期肝纤维化平均ADC值分别为[(x±S)×10-3]:(1.542±0.299)×10-3、(1.334±0.268)×10-3、(1.108±0.198)×10-3、(0.978±0.169)×10-3、(0.680±0.260)×10-3 ,呈下降趋势。对照组与1期、2期、3期、4期比较有显著性差异;1期与2期、3期、4期比较,2期与4期比较,3期与4期比较均有显著性差异;2期与3期比较差异无统计学意义。ADC值与肝纤维化分期的相关性分析:r=-0.766(p㩳0.001)。(4)EADC值分析:对照组与1期、2期、3期、4期肝纤维化平均EADC值分别为[(x±S)×10-3]:(0.315±0.068)×10-3、(0.345±0.081)×10-3、(0.411±0.074)×10-3、(0.465±0.056)×10-3、(0.595±0.106)×10-3,呈增高趋势。对照组与2期、3期、4期比较有显著性差异,1期与2期、3期、4期比较,2期与4期比较,3期与4期比较均有显著性差异。对照组与1期比较,2期与3期比较差异无统计学意义。EADC值与肝纤维化分期的相关性分析:r=0.753 (p㩳0.001)。 4.结论: (1)DWI信号强度随着肝纤维化分期的增加而增高,各叶纤维化进展不近相同; (2)梯度因子b取600 s/mm2或800 s/mm2时,即可避免灌注对弥散的影响(低b值),又具有较高的信噪比,为肝脏DWI成像较理想的b值取值;(3)ADC值(1-4期)和EADC值(2-4期)均能对肝纤维化进行分期,且均具有较好的相关性。第三部分大鼠肝纤维化的MR波谱成像(1H-MRS) 1.目的: 通过分析大鼠不同程度肝纤维化的MRS代谢物波峰峰高、波峰下面积及其相互比值的变化,以探讨应用MRS检测方法对肝纤维化早期诊断、量化分析及其分期的价值。 2.方法: 第一部分在大鼠给药建立肝纤维化模型过程中,每周随机抽取模型组大鼠4只,对照组大鼠1只,采用3D PRESS多体素1H-MRS序列进行MR波谱成像,手动标记波谱图像中不同代谢物,软件自动生成各代谢物的峰高和波峰下面积,分别计算代谢物与脂质的峰高、波峰下面积的比值(Cho/lip、Glx/lip、Lac/lip、Cr/lip)并与病理分期对照。 3.结果: 对照组大鼠肝脏波谱成像可见5个主要波峰;模型组大鼠脂质峰下降,其余代谢物波峰不同程度增高。代谢物与脂质波峰峰高比值:(1)对照组与1期、2期、3期、 4期肝纤维化Cho/lip比值分别为(x±S):0.052±0.034、0.212±0.225、0.117±0.122、0.403±0.299、0.438±0.295。对照组与3期、4期比较P㩳0.05,对照组与1期、2期比较,1期、2期分别与各组比较P㧐0.05。(2)对照组与1期、2期、3期、4期肝纤维化Glx/lip比值分别为(x—±S):0.150±0.132、0.406±0.650、0.656±0.551、0.750±0.452、0.763±0.517。对照组与2期、3期、4期比较P㩳0.05,与1期比较P㧐0.05,余各组两两比较P㧐0.05。(3)对照组与1期、2期、3期、4期肝纤维化Lac/lip比值分别为(x—±S):0.139±0.128、0.262±0.178、0.251±0.344、0.355±0.446、0.233±0.185,差异无统计学意义(P㧐0.05),但随分期增加有增高趋势。(4)对照组与1期、2期、3期、4期肝纤维化Cr/lip比值分别为(x±S):0.136±0.274、0.767±0.902、0.638±0.960、0.917±0.576、0.778±0.856。对照组与3期比较P㩳0.05,余各组两两比较差异无统计学意义。代谢物与脂质波峰峰高比值与肝纤维化分期的相关性分析:Cho/lip(r=0.503 p㩳0.001)、Glx/lip(r=0.388 p㩳0.05)、Lac/lip(r=0.124 p㧐0.05)、Cr/lip(r=0.235 p㧐0.05)。肝脏主要代谢物与脂质波峰下面积比值:(1)对照组与1期、2期、3期、4期肝纤维化Cho/lip比值分别为(x±S):0.115±0.133、0.257±0.316、0.167±0.187、0.185±0.328、0.468±0.372。对照组与4期比较P㩳0.05,余两两比较差异无显著性。(2)对照组与1期、2期、3期、4期肝纤维化Glx/lip比值分别为(x±S):0.045±0.039、0.540±0.318、0.448±0.364、0.482±0.402、0.531±0.336。对照组与1期、2期、3期、 4期比较P㩳0.05,余各组之间比较P㧐0.05。(3)对照组与1期、2期、3期、4期肝纤维化Lac /lip比值分别为(x—±S):0.062±0.069、0.258±0.266、0.277±0.320、0.170±0.314、0.274±0.312。差异无统计学意义(P㧐0.05),但随分期增加有增高趋势。(4)对照组与1期、2期、3期、4期肝纤维化Cr/lip比值分别为(x±S):0.109±0.231、0.481±0.614、0.704±0.797、0.465±0.525、0.810±0.706。对照组与4期比较P㩳0.05,与1期、2期、3期比较及余各组之间两两比较P㧐0.05。代谢物与脂质波峰下面积比值与肝纤维化分期的相关分析:Cho/lip(r=0.282 p㧐0.05)、Glx/lip(r=0.313 p㩳0.05)、Lac/lip(r=0.135 p㧐0.05)、Cr/lip(r=0.267 p㧐0.05)。 4.结论: (1)Cho/lip、Glx/lip、Cr/lip波峰峰高比值对肝纤维化分期(Cho/lip对3-4期、Glx/lip对2-4期、Cr/lip对3期)具有一定的价值;代谢物与脂质波峰峰高比值与肝纤维化分期的相关性以Cho/lip、Glx/lip较高。(2)Cho/lip、Glx/lip、Cr/lip波峰下面积比值对肝纤维化分期(Cho/lip、Cr/lip对4期;Glx/lip对1～4期)具有一定的价值;代谢物与脂质波峰下面积比值与肝纤维化分期的相关性以Glx/lip较高(。3)Lac/lip波峰峰高比值、波峰下面积比值对肝纤维化分期均无意义,但均随分期增加呈增高趋势。第四部分大鼠肝纤维化的MR灌注成像(PWI) 1.目的: 通过分析不同程度肝纤维化的PWI的灌注参数变化,以探讨应用PWI检测方法对肝脏纤维化早期诊断、量化分析及其分期的价值。 2.方法: 第一部分在大鼠给药建立肝纤维化模型过程中,每周随机抽取模型组大鼠4只,对照组大鼠1只,采用单次激发SE-EPI序列进行MR灌注成像:经大鼠尾静脉快速团注Gd-BOPTA,剂量为0.2mmol/kg体重,流率2ml/s,连续扫40个动态,覆盖整个肝脏。应用Perfusion软件自动生成肝实质信号强度-时间曲线,计算相关参数:(1)最大信号下降百分率(SRRmax),(2)到达峰值时间(TTP),(3)平均通过时间(MTT)。分析PWI灌注参数值并与病理肝纤维化分期对照。 3.结果: (1)肝实质信号强度-时间曲线:对照组曲线呈快速下降、达峰值后缓慢恢复,恢复幅度较大,恢复时程较短;模型组曲线下降速度减慢,下降幅度减小,达峰值时间延长,达峰值后恢复幅度较小,恢复时程较长,波峰宽大,随着肝纤维化分期的增高这种改变更加明显。(2)肝脏灌注参数与肝纤维化分期的关系:1)对照组与1期、2期、3期、4期肝纤维化SRRmax值分别为[(x±S)×100%]:0.754±0.073、0.674±0.137、0.632±0.154、0.603±0.201、0.535±0.135。对照组与3期、4期比较P㩳0.05,与1期、2期比较差异无显著性,余各组两两比较P㧐0.05。2)对照组与1期、2期、3期、4期肝纤维化TTP值分别为[(x±S)s]:14.175±4.845、18.433±7.293、26.789±3.621、31.755±7.308、35.213±6.322。对照组与2期、3期、4期比较P㩳0.05,与1期比较无显著性差异;1期与2期、3期、4期比较,2期与4期比较P㩳0.05;2期与3期比较,3期与4期比较P㧐0.05。3)对照组与1期、2期、3期、4期肝纤维化MTT值分别为[(x—±S)s]:24.620±5.577、28.945±2.758、32.502±4.268、35.861±4.651、35.203±5.674。对照组与2期、3期、4期比较P㩳0.05, 1期与3期、4期比较P㩳0.05,对照组与1期比较,1期与2期比较,2期与3期、4期比较,3期与4期比较差异均无统计学意义。肝脏灌注参数与肝纤维化分期的相关分析:SRRmax(r=-0.439 p㩳0.05)、TTP(r=0.798 p㩳0.001)、MTT(r=0.647 p㩳0.001)。 4.结论: (1)肝纤维化大鼠肝实质信号强度-时间曲线呈慢降缓升型,波峰低平宽大;(2)SRRmax、TTP、MTT灌注参数分析有助于肝纤维化分期(SRRmax对3-4期、TTP、MTT对2-4期)。SRRmax、TTP、MTT灌注参数与肝纤维化分期均有较好的相关性,其中以TTP和MTT较高。第五部分大鼠肝纤维化的肝细胞特异性对比剂MR成像 1.目的: 通过对大鼠肝纤维化模型进行Gd-BOPTA增强动态观测,分析不同程度肝纤维化各延迟时间点的动态增强表现、强化程度,并与病理分期对照,以探讨应用Gd-BOPTA增强延迟扫描方法对肝脏纤维化早期诊断、定量分析及其分期的价值。 2.方法: 第一部分在大鼠给药建立肝纤维化模型过程中,每周随机抽取模型组大鼠4只,对照组大鼠1只,进行Gd-BOPTA增强MR扫描:经大鼠尾静脉快速团注Gd-BOPTA,剂量为0.2mmol/kg体重,以TSE-T1WI序列分别于注射对比剂后60min(RER1)、120 min(RER2)、180 min(RER3)时间点延迟扫描,分别测算各不同时间点的信号强度、肝实质相对强化率;观察不同程度肝纤维化大鼠各不同时间点的胆管、血管信号强度变化特点。 3.结果: 不同时间点肝实质相对强化率与肝纤维化分期的关系:(1)对照组与1期、2期、3期、4期肝纤维化RER1值分别为(x±S):1.436±0.374、1.487±0.477、1.476±0.440、1.489±0.431、1.476±0.436。各组差异无统计学意义(P㧐0.05),但随肝纤维化分期的增加有增高趋势。(2)对照组与1期、2期、3期、4期肝纤维化RER2值分别为(x—±S):1.220±0.370、1.292±0.387、1.344±0.367、1.371±0.388、1.405±0.370。各组差异无统计学意义(P㧐0.05),但随肝纤维化分期的增加有增高趋势。(3)对照组与1期、2期、3期、4期肝纤维化RER3值分别为(x±S):0.844±0.275、0.910±0.380、1.041±0.399、1.209±0.299、1.241±0.398。对照组与3期、4期比较P㩳0.05,与1期、2期比较P㧐0.05,肝纤维化各期之间两两比较P㧐0.05。不同时间点肝实质相对强化率与肝纤维化分期的相关分析:RER1(r=0.039 p㧐0.05)、RER2(r=0.174 p㧐0.05)、RER3(r=0.420 p㩳0.05)。胆管、血管显影情况: MR增强延迟期:肝内血管树T1WI为低信号;胆道树T1WI表现为高信号。实验组大鼠肝脏门静脉树和胆管树分支走行迂曲、粗细变化不规律,胆管树见延迟强化。 4.结论: (1)对比剂Gd-BOPTA增强后60min、120 min时间点肝实质相对强化率对肝纤维化分期无价值,延迟后180 min时间点肝实质相对强化率对肝纤维化分期(3-4期)具有一定的价值,不能对早期肝纤维化(1-2期)进行分期。(2)肝纤维化大鼠胆管树形态改变、延迟强化,提示肝纤维化时胆系重构、肝细胞功能受损。第二篇磁粒子标记大鼠BMSCs移植修复肝损伤的MR活体示踪实验研究肝功能衰竭是各种慢性肝病主要的死亡原因,原位肝移植是目前治疗终末期肝病的最有效的方法,但由于供肝严重缺乏,远无法满足临床需求。肝脏的细胞移植为病损肝脏的细胞重建和衰竭肝脏的功能恢复提供了一种新的治疗策略,使患者有可能利用自身的骨髓干细胞作为种子细胞,来修复自体组织的病变和损伤。干细胞移植示踪研究,对动态监测活体内移植细胞的分布、迁移、分化及评估细胞移植效果具有重要作用,但干细胞移植示踪技术一直是医学科研中的难题。传统的移植细胞的示踪方法必须在离体状态下通过组织学观察来实现。因此,迫切需要建立一种安全无创、敏感有效、适于临床的移植细胞活体示踪技术。MR活体示踪在干细胞的研究中日益受到关注,利用MR敏感的对比剂作为分子探针标记供体移植细胞,移植后对受体进行MRI检测是活体观察移植细胞存活和分布的新技术。应用MR活体示踪技术研究肝纤维化形成环境中移植的BMSCs分布、迁移规律尚未见报道。本研究通过对大鼠BMSCs的分离、增殖和鉴定,采用Brdu和SPIO双标记大鼠BMSCs,对大鼠肝纤维化模型进行同种异体移植后,行MR活体动态观测,并与病理组织学对照,以探讨大鼠BMSCs的分离、增殖和鉴定技术,和SPIO作为分子探针标记BMSCs MR活体示踪的可行性,以及MR成像的最佳扫描参数及成像序列,并探讨移植细胞在肝脏纤维化环境中分布、迁移特点及其对肝损伤的修复作用,以及相应的MR信号变化规律,探索临床应用型1.5T MR用于干细胞示踪研究的可行性,为干细胞移植MR活体示踪的临床应用奠定基础。第一部分大鼠骨髓基质细胞的体外分离、培养、鉴定和标记 1.目的: 观察大鼠骨髓基质细胞在体外培养的条件,并利用Brdu和超顺磁性氧化铁颗粒对大鼠BMSCs进行双标记,为应用MR对移植骨髓基质细胞进行活体示踪研究奠定基础。 2.方法: 取60~90g SD大鼠,体外培养骨髓基质细胞,利用倒置相差显微镜观察原代及不同传代细胞生长、形态特点,并应用流式细胞仪鉴定原代及不同传代细胞表型。利用Brdu和PLL介导的超顺磁性氧化铁颗粒对大鼠BMSCs进行双标记。 3.结果: 培养的骨髓基质细胞第3代,骨髓基质细胞的细胞表面标志CD90表达阳性的细胞已占到93.1%。造血干细胞的表面标志CD45表达阳性的细胞已从原代的71.2%降低到3.9%。PLL介导的超顺磁性氧化铁颗粒对大鼠BMSCs标记率达100%。 4.结论: 传代3的BMSCs可作为细胞移植治疗的理想细胞来源。PLL介导的超顺磁性氧化铁颗粒可高效率地标记大鼠BMSCs。第二部分磁粒子标记大鼠骨髓基质细胞的体外MR成像实验 1.目的: 探讨标记细胞不同细胞数量所引起的MR信号强度变化规律,以及磁粒子标记细胞MR示踪最敏感的成像序列,为标记细胞活体内MR示踪奠定基础,并提供理论依据。 2.方法: 用1%的琼脂糖混悬Brdu和SPIO双标记的BMSCs(分别为2×106、1×106、5×105个)和未标记的BMSCs (2×106个),分别置于不同EP管中。行冠状位和轴位TSE序列T1WI、T2WI和FFE-T2WI扫描,测量相同细胞数量不同成像序列以及相同成像序列不同细胞数量的信号强度,并比较MR信号变化率。 3.结果: 磁粒子标记的各不同数量BMSCs各成像序列MR信号变化率(:1)标记组5×105、1×106、2×106个细胞TSE-T1WI序列MR信号变化率分别为[(x±S)%]:-4.19±0.79、-16.35±1.23、-22.80±1.05。(2))标记组5×105、1×106、2×106个细胞TSE-T2WI序列MR信号变化率分别为[(x—±S)%]:-14.15±1.37、-35.09±1.39、-53.02±1.30。(3)标记组5×105、1×106、2×106个细胞FFE-T2WI序列MR信号变化率分别为[(x±S)%]:-44.98±0.46、-69.38±0.82、-87.24±0.82。同一扫描序列中各标记细胞组之间以及相同标记细胞数量各成像序列之间两两比较P㩳0.001,差异均有统计学意义。 4.结论: 磁粒子标记BMSCs,细胞浓度相同条件下,以FFE-T2WI序列信号下降最为明显,标记的细胞数量越多,信号改变越明显,呈细胞数量依赖性。FFE-T2WI序列为磁粒子标记细胞MR示踪的理想序列。第三部分大鼠骨髓基质细胞的同种异体肝移植 1.目的: 经门静脉途径和肝内途径进行肝脏的BMSCs移植,探讨两种移植途径的特点,为比较两种移植途径的MR示踪效果及信号变化特点,及了解移植细胞在靶器官的分布、迁移规律奠定基础。 2.方法: 将第一篇、第一部分中建立的SD大鼠肝纤维化模型20只分为4组,1组:生理盐水对照组(注射不含BMSCs的等容生理盐水,其中经门静脉2只,经肝内注射2只);2组:未标BMSCs对照组(移植2×106个未经Brdu和SPIO标记的BMSCs,其中经门静脉2只,经肝内注射2只);3组:经门静脉移植BMSCs标记组(经门静脉移植2×106个经Brdu和SPIO标记的BMSCs,6只);4组:经肝内移植BMSCs标记组(经肝内移植2×106个经Brdu和SPIO标记的BMSCs,6只)。手术暴露门静脉主干和肝脏,以微量注射器抽取相应移植内容,穿刺各组目标,缓慢注入。 3.结果: 经肝内注射组:手术操作简便,细胞移植顺利。经门静脉移植组:有3只大鼠因腹膜、系膜粘连,门静脉主干分离困难,给移植手术带来一定的难度,其余大鼠移植手术顺利。因实验大鼠均出现门静脉主干不同程度增粗,门静脉主干穿刺均获成功。缓慢注入移植细胞或生理盐水后,大鼠未出现异常反应。手术切口愈合良好。 4.结论: 经门静脉途径和经肝内注射途径对肝脏进行BMSCs移植,安全、易行。第四部分大鼠骨髓基质细胞同种异体肝移植的MR活体示踪研究 1.目的: 探讨经门静脉途径和经肝内途径移植标记细胞的MR活体示踪效果及信号变化特点,从而了解肝纤维化环境中移植细胞在靶器官的分布、迁移规律及其对肝损伤的修复作用,为移植干细胞MR活体示踪的临床应用奠定基础。 2.方法: 第三部分移植术后各组大鼠每组随机抽取2只,分别于移植术后2h、3d、7d、2w行TSE序列轴位T2WI-SPAIR、T1WI和FFE-T2WI扫描,对不同序列图像的移植细胞显影效果进行比较;观察各移植组不同时间点的MR信号强度、分布范围及其变化规律。于MR扫描后随机抽取每组大鼠各一只处死,取肝脏标本,并取部分大鼠肺和脾脏组织,采用HE染色、含铁血黄素染色、Brdu免疫组织化学染色。观察含铁血黄素染色阳性细胞和Brdu免疫组织化学染色阳性细胞在肝、肺、脾脏中的分布。 3.结果: (1)MR检查:在各扫描序列中,以FFE-T2WI序列成像效果最佳。1组和2组:移植术后2h、3d、7d、2w不同时间点、各序列MR图像均未见异常信号改变。3组:移植术后2h,肝门区见多发结节状低信号灶,并随时间延长向肝内分散,低信号结节逐渐变小。移植术后2w示踪效果较差。4组:移植术后2h,局部见团状低信号灶,随时间延长范围逐渐扩大,边缘逐渐模糊,移植术后2w低信号区仍较明显。 (2)病理组织学检查:1)HE染色:移植术后2h、3d各组肝内坏死、炎症及纤维组织增生情况基本类似;移植术后7d、2w,与1组比较,2～4组大鼠肝组织坏死、炎症细胞浸润情况逐渐好转,以经门静脉移植组明显。2)含铁血黄素染色:1组和2组:移植术后2h、3d、7d、2w,肝脏、肺和脾脏含铁血黄素染色,均未见阳性细胞。3组:移植术后2h含铁血黄素染色阳性细胞主要分布于肝门部门静脉内,移植术后3d阳性细胞主要分布于门静脉小分支、肝窦内、肝小叶中央静脉周围,移植术后7d、2w阳性细胞主要分布于损伤较重的肝实质和纤维间隔;各时间点组织学所见与MR成像信号改变一致。同期的肺和脾脏含铁血黄素染色,其内可见少量阳性细胞散在分布。4组:移植术后2h、3d、7d、2w可见含铁血黄素染色阳性细胞密集分布于注射点,随时间延长细胞向周围肝内迁移。各时间点组织学所见与MR成像信号改变一致。同期肺内未见明显阳性细胞,脾脏内可见少量阳性细胞分布。3)Brdu免疫组织化学染色:结果与含铁血黄素染色一致。 4.结论: (1)FFE-T2WI序列为肝内移植磁粒子标记细胞MR活体示踪的理想序列;(2)经门静脉途径移植BMSCs细胞随时间逐渐向肝内移行,以损伤较重区和纤维间隔分布明显,具有选择性分布特点;移植的部分BMSCs与肝细胞紧密连接,形成规则的肝细胞索,对肝损伤具有修复作用;经门静脉途径移植BMSCs为细胞移植治疗肝脏弥漫性病变的较理想途径,但MR示踪时间窗较短;经肝内途径移植BMSCs细胞分布局限,MR示踪时间窗较长;(3)MR信号变化规律与组织学证实的移植细胞在靶器官的分布、迁移规律具有较好的一致性;(4)MR信号变化规律在一定程度上反映了移植细胞在肝内的分布、迁移、增殖和分化状态;(5)临床应用型1.5T MR可用于肝脏干细胞移植的活体示踪研究。结论 1.应用复合因素(CCl4+酒精)能成功地建立不同病理分期的大鼠肝纤维化模型,有较明显的阶段性变化。 2. DWI信号强度随着肝纤维化分期的增加而增高;梯度因子600 s/mm2或800 s/mm2为肝脏DWI成像较理想的b值取值;ADC值和EADC值均能对肝纤维化进行分期(ADC值对1-4期;EADC值对2-4期),具有较好的相关性。 3. Cho/lip、Glx/lip、Cr/lip波峰峰高比值(Cho/lip对3-4期、Glx/lip对2-4期、Cr/lip对3期)及波峰下面积比值(Cho/lip对4期、Glx/lip对1-4期、Cr/lip对4期)对肝纤维化具有一定的分期价值;Lac/lip波峰峰高及波峰下面积比值对肝纤维化分期均无意义。 4.肝纤维化大鼠肝实质时间-信号强度曲线呈慢降缓升型,波峰低平宽大;灌注参数SRRmax(对3-4期)、TTP(对2-4期)、MTT(对2-4期)对肝纤维化分期具有一定的价值。 5. Gd-BOPTA增强后延迟60min、120 min时间点肝实质相对强化率对肝纤维化分期无价值,延迟180 min时间点肝实质相对强化率对肝纤维化分期(3-4期)具有一定的价值,但对较早期肝纤维化分期(1-2期)不敏感。 6.传代3的BMSCs细胞可作为细胞移植治疗的理想细胞来源;SPIO-PLL可高效率标记大鼠BMSCs。 7.在体外,FFE-T2WI序列信号下降程度随标记细胞数量增多而增大,示踪效果呈标记细胞数量依赖性。 8.在活体,FFE-T2WI序列为磁粒子标记BMSCs肝移植MR示踪的理想序列。 9.经门静脉途径肝脏BMSCs细胞移植为细胞移植治疗肝脏弥漫性病变的较理想途径。 10.在肝纤维化环境中,移植的BMSCs随时间逐渐向肝实质和纤维间隔内移行,以损伤较重区和纤维间隔分布明显,具有选择性分布特点;移植的BMSCs能与肝细胞紧密连接,形成规则的肝细胞索,对肝损伤具有修复作用。但经门静脉移植BMSCs MR示踪时间窗较短;经肝内途径移植BMSCs细胞分布局限,MR示踪时间窗较长。 11. MR信号变化规律与组织学证实的移植细胞在靶器官的分布、迁移规律具有较好的一致性;MR信号变化规律在一定程度上反映了移植细胞在肝内的分布、迁移、增殖和分化状态。 12.临床应用型1.5T MR可用于肝脏干细胞移植的活体示踪研究。
【图文】：

分析纯

3 期：纤维间隔伴小叶结构紊乱，无肝硬化。4 期：早期肝硬化。6. 透射电子显微镜观察肝组织超微结构变化包括肝细胞形态、细胞核、细胞器变化，肝窦形态、内皮细胞变化，Disse 间隙、肝小叶内纤维组织增生等。结果1.动物生存状况 160 只 SD(Sprague-Dawley)大鼠，对照组 20 只，实验组 140 只。实验组大鼠每次皮下注射 40%CCl4油溶液约 5~10min 后，出现四肢瘫软，腹肌松弛，嗜睡，食欲下降。随着造模时间的延长，食欲逐渐下降，精神萎靡，活动减少，易怒好斗，出现易出血倾向；体重逐渐减轻，，消瘦，出现营养不良，毛发蓬乱、无光泽（图1b），尿黄，部分大鼠出现稀便。实验组共有 94 只大鼠完成实验，死亡 46 只，死亡率 33%。对照组大鼠未出现上述表现，且体重逐渐增加，毛发有光泽（图 1c），全部存活。

营养不良,毛发,大鼠,实验组

活动减少，易怒好斗，出现易出血倾向；体重逐渐减轻，消瘦，出现营养不良，毛发蓬乱、无光泽（图1b），尿黄，部分大鼠出现稀便。实验组共有 94 只大鼠完成实验，死亡 46 只，死亡率 33%。对照组大鼠未出现上述表现，且体重逐渐增加，毛发有光泽（图 1c），全部存活。图 1a 99.9%分析纯 CCl4图 1b 实验组大鼠营养不良，毛发蓬乱图 1c 对照组大鼠
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R575.2;R445.2

【参考文献】