【摘要】： 背景和目的： 血管新生(angiogenesis)是指在机体生长发育过程中或创伤修复、缺血缺氧和炎症等情况下,原有微血管内皮细胞(endothelial cell, EC)经过生芽、迁移、增殖与基质重塑等形成新毛细血管的过程。在组织再生、发育和创伤修复过程中,血管形成是一个基本的生理过程,如各种创伤、溃疡、心肌梗塞、慢性感染等愈合过程都需要血管形成的参与,但是在许多病理状态下也存在血管生成失调,例如糖尿病视网膜病、动脉硬化和实体肿瘤等严重危害人类健康的疾病中。因此,高敏感性、无创性、靶向性、早期定量评价血管新生对于心血管疾病(主要是缺血性心脏病和外周动脉闭塞性疾病)和肿瘤性疾病都具有重要的意义。对于心血管疾病来说,通过显示新生血管数量和空间分布来评估微血管对生长因子的早期反应,对指导向缺血局部组织输送促血管合成蛋白或基因是十分有用的。对于肿瘤性疾病来说,及早显影新生血管则能早期发现肿瘤及微小转移灶,有利于病人的早期治疗；而动态性的监测新生血管则可以评估抗肿瘤治疗的效果。 超声分子成像是近年来兴起的一门无创性分子影像技术,它是通过对普通超声微泡表面进行特殊处理,将靶向于病变组织特定分子的特异配体连接于普通超声微泡外壳构建成靶向超声微泡,后者经静脉注入后靶向性黏附、聚集并较长时间滞留于靶组织中,再通过对比超声(contrast-enhanced ultrasound, CEU)检查而产生分子水平的特异的“主动性靶向超声分子显像”(active targeted ultrasound molecular imaging)的一门新兴的超声成像技术。近几年来,运用靶向超声分子成像技术评价血管新生应已日益成为国内外超声领域的研究热点,并已经实现了从分子水平对肿瘤性和缺血性血管新生的初步评价。Ellegala等构建携Echistatin的靶向微泡可以有效评价大鼠恶性神经胶质瘤模型的新生血管。Leong-Poi等通构建了携带抗αv-整合素单抗的靶向超声微泡,体外实验发现该靶向微泡与基质胶新生血管的结合率明显高于正常血管内皮细胞。 基质胶是一种来源于EHS小鼠肿瘤细胞提取的基底膜的复合物。它在4℃的时候为液态,但在室温条件下,可自动聚集产生类似于哺乳动物细胞基底膜的生物活性基质材料,它具有良好的可操作性和可重复性,是公认的血管新生模型,已被广泛应用于血管新生的实验研究。将基质胶注入皮下后,内皮细胞向基质胶中迁移形成新生血管,血管形成过程大约在10天左右完成,当加入适当浓度的促血管生成因子后,可以加快血管的生成。 碱性成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor-2, FGF-2)是体内发现的最为有效的血管形成因子之一。它对新生血管形成过程中多个环节如毛细血管基底膜降解、内皮细胞迁移增生、胶原合成、小血管腔形成均有明显促进作用,并且可以下调基质金属蛋白酶的活性。已证实FGF-2在体内、外均有明显的促新生血管形成作用。FGF-2可促进具有基底膜作用的蛋白激酶释放,从而促进毛细血管基底膜降解,促进小血管的形成。FGF-2能促进αv-整合素的表达,而αv-整合素是良好的血管新生成像靶点。理论上,不同浓度的FGF-2将诱导不同程度的αv-整合素表达。因此,本研究将不同浓度的FGF-2分别加入到基质胶中构建不同程度的血管新生模型。 Leong-Poi等使用αv-整合素靶向超声微泡对基质胶模型进行对比超声研究,靶向超声微泡的声强度高于普通微泡(P0.05),但未设立封闭组探讨靶向超声微泡评价血管新生的特异性。Stieger等用非靶向微泡评价基质胶模型的血管新生,免疫组化的微血管密度和超声的增强区域正相关(r=0.65,P0.05)。虽然,超声分子成像评价血管新生已经取得了初步成功,但目前仍没有对靶向超声分子成像评价血管新生的特异性和定量化进行研究的报道。因此,我们通过分别向基质胶中加入不同量的FGF-2,建立基质胶血管新生模型,并通过单抗封闭新生血管αv-整合素分子靶点的方法建立阴性对照模型,旨在探讨携带αv-整合素分子探针的超声分子成像评价不同浓度碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)介导的血管新生,并对血管新生的定量化评价进行初步的研究。 材料和方法 1、超声微泡的制备：各种脂质材料按一定比例75℃水浴溶解于适量蒸馏水中,同时通全氟丙烷(C3F8)气体,超声振荡至形成乳白色液体制备生物素(Biotin)化脂质微泡。生物素化脂质微泡经静置弃下清液并加入等量蒸馏水去除未结合脂质纯化4次后,按一定比例加入抗生蛋白链菌素／亲和素(streptavidin)。继续静置弃下清液并加入等量蒸馏水去除未结合抗生蛋白链菌素纯化微泡2次后得到外壳结合有抗生蛋白链菌素的脂质微泡,再按一定比例加入生物素化鼠抗人αv-整合素单抗(Biotin conjugated mouse Anti-humun avMonoclone Antibody)得到携带抗αv-整合素单抗靶向微泡(MBα),最后静置弃下清液并加入等量蒸馏水去除未结合抗体,纯化携带抗αv-整合素单抗靶向微泡(MBα)2次。用上述方法构建携同型抗体微泡作为对照微泡(MBc)。MBα和MBc均于冰箱中4℃保存备用。采用库尔特计数仪测量MBα及MBc的平均粒径及浓度。 2、MBα的体外鉴定：采用绿色荧光标记的二抗与抗αv-整合素单抗结合,荧光显微镜下观察抗αv-整合素单抗与微泡的连接情况。采用平行板流动腔技术在体外模拟的生理血流条件下评价MBα与αv-整合素Fc段(Recombinant humanαv-integrin/Fc Chimera,αvSFc)的靶向黏附效能。 3、基质胶模型的制备：在昆明小鼠皮下注射基质胶以促进血管新生,分别向基质胶中添加不同量的FGF-2 (sigma公司),配成浓度为1μg/mL和0.5μg/mL的两种基质胶,并加入肝素(64U/mL)。将20只小鼠随机分为2组,分别注射两种浓度的基质胶。20只昆明小鼠经常规麻醉后,在左侧腹部皮下注射0.6ml基质胶,在基质胶注射部位形成椭圆形隆起。 4、CEU检查：在注射基质胶10天后,将小鼠麻醉后进行对比超声检查。将自制水囊放在小鼠的左侧腹部,用自制支架固定超声探头(17L5)于水囊上。调整探头位置获得良好图像后保持探头位置在整个实验过程中不变,仪器的各项参数在整个实验过程中保持不变。CEU采用经尾静脉微泡弹丸式注射法进行,超声造影采用经尾静脉随机(间隔30min)先后注射MBα和MBC(约为5×106个)。经过6min循环时间待血池中循环微泡消失后对实验小鼠进行注射基质胶的部位进行CEU检查,获取显影图像。CEU检查采用二次谐波成像(second harmonic imaging)技术进行,探头发射和接收频率分别为7 MHz和14MHz,机械指数(Mechanical Index, MI)为0.18,超声发射间隔(Pulsing Interval, PI)时间设定为10s,获取第一帧CEU图像后给予高MI(1.9)连续超声发射2-3s以破坏微泡,继续存储本底图像4-5帧,全部声学造影图像存于CD盘,以备脱机分析。采用MCE软件分析CEU图像,测量实验小鼠注射基质胶的部位显影的声强度(video intensity, VI)数值并制作彩色编码图。采用红色、橙色和白色分别代表基质胶显影程度由强到弱。 5、病理学检查和免疫组化检查：完成CEU图像采集后,取出实验小鼠基质胶,10%甲醛固定,行病理学和免疫荧光检查。 6、平均荧光强度(median fluorescence:intensity, MFI)测定和血管计数(micro vessel count, MVC):在荧光照片选取相同面积的50个区域,使用Imagepro plus6.0软件分析平均荧光强度。 ①得到灰度图片； ②黑白反相； ③光密度校正； ④在count/size中选择强度阂值10-200,过滤掉明亮的杂质荧光点； ⑤选择面积area与积分光密度(IOD)过滤值30像素； ⑥IOD/area得到该区域像素的平均灰度,即代表平均荧光强度,然后计算这50个区域的平均值。 单位面积血管计数：在上述50个区域,以有管腔结构为准,进行血管计数,计算单位面积血管计数。 结果 1、微泡制备情况：采用库尔特计数仪测得MBc粒径为2.12±1.13μm,浓度约为2.80～4.56×108个／ml；MBα粒径2.08±0.65μm,浓度约为3.07～4.75×108个／ml。 2、MBα体外鉴定结果：采用绿色荧光标记的二抗与抗αv-整合素单抗结合,荧光显微镜下观察显示MBa外壳显明显绿色荧光,表明抗αv-整合素单抗与微泡外壳连接效果良好。平行板流动腔体外评价结果显示,在模拟微血管生理血流条件的剪切应力(1.0dyn／cm2)下MBα可与包被于平行板流动腔的αvSFc有效结合,显示了很好的主动性靶向黏附效能。 3、超声造影检查：MBα注射后基质胶外周带及周围组织均可见明显的超声显影,而基质胶中心部位未见超声显影,6min后周围组织未见显影,而基质胶外周带仍可见明显的超声显影,MBc注射后显影情况与MBa基本相同,但6min后基质胶未见明显的超声显影。预先用αv-整合素抗体封闭后,MBα及MBc注射后基质胶也可呈明显的超声显影,但6min后MBα和MBc均未见明显的超声显影。 4、图像分析结果：在高浓度组中,封闭前基质胶模型中MBa组呈明显的超声显影,而MBc组仅见轻度的超声显影,两者之间有明显差异(P0.05)。预先单抗封闭αv-整合素后,MBa和封闭前的MBα之间有明显差异(P0.05)；而MBc的Ⅵ值较封闭前无明显变化,两者之间无明显差异(P0.05)。低剂量组同样出现上述结果。 5、基质胶病理及免疫荧光结果：HE染色切片显示,小鼠基质胶外周带可见丰富的新生血管,血管中可见红细胞的存在；高浓度FGF-2组基质胶中新生血管多于低浓度FGF-2组；高浓度组血管密度高,而且更靠近中央区。免疫荧光显示基质胶新生血管内皮细胞有大量的αv-整合素,高浓度FGF-2组基质胶内皮细胞中表达的αv-整合素多于低浓度FGF-2组,封闭后内皮细胞中几乎不表达αv-整合素。 6.在超声造影中,高浓度组封闭前MBα造影Ⅵ值是低浓度组封闭前的1.4倍；高浓度组封闭后MBα造影Ⅵ值是低浓度组封闭前的1.37倍。在免疫荧光强度测定中,高浓度组封闭前单位面积免疫荧光强度是低浓度组封闭前的1.32倍；高浓度组封闭后是低浓度封闭后的1.33倍。在单位面积血管计数中,高浓度组封闭前是封闭后的1.2倍；高浓度组封闭前MBα造影Ⅵ值是低浓度组封闭前的1.16倍。 结论： 1、采用“抗生物素蛋白／生物素复合体”可实现抗αv整合素单抗与脂质微泡外壳的有效连接而成功构建携带抗αv-整合素单抗靶向微泡； 2、应用携带αv-整合素分子探针的超声分子成像可有效特异地评价基质胶血管新生,实现对新生血管的早期评价和诊断； 3、αv-整合素可以作为新生血管分子成像的靶点,使用基质胶模型评价血管新生的研究具有良好的特异性,可用于定量化研究。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R445.1
【图文】：
采川绿色荧光标一记的_二抗与抗以v整合索单抗结合，荧光{l己微镜下观察{l适示MB‘，，.1}则{!及绿色荧光，表明‘1二物索化抗。v一整合索单抗.习一通过抗/}:.物素蛋自(抗‘卜蛋自链菌索)’、‘丰几物素化脂质微泡有效连接(图l，图2)。咚11:1别A及图B分别{，退习功!}入绿色荧光标记MB、在荧光显微镜卜照少{二和}司视野显-.-抗微镜‘常光卜一照少200一)。
量组对比超声图像基质胶的vl值，与MBC相比较，*P<0.05;与封比较，洲尸<0.05。度FGF一2刺激组:对比超声检查声强度(VideoIntensit丫Vl)(x士强度单位:VideoIntensityunit，u)因素封闭前封闭后SllmBa14.60士2.723.50士1.0710.56士5.86189.BC4.34士1.023.67士1.214.37士1.270.0um11.21士8.304.00士0.9810.26士7.86187.9F387.630.6216908*
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2733861
