人脐血内皮祖细胞Ferumoxides、P7228与Gd-BOPTA标记及体外MR成像研究

发布时间：2020-07-26 15:58

【摘要】：背景: 细胞移植是近年众多领域的研究热点,干细胞移植至今已有30多年的历史,并且已经从动物实验逐渐向临床应用过渡。Asahara等首次从人外周血中分离到一类可以分化为成熟内皮细胞的特殊血细胞,将它命名为循环内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs),并利用小鼠模型证明了骨髓源性的EPCs参与了出生后血管生成。随后的研究表明,EPCs在血管组织工程、冠心病治疗、肿瘤研究、创伤愈合等方面具有广阔的应用前景。鉴于EPCs潜在的临床应用价值,有望通过移植EPCs治愈或改善某些疾病,提高病患的生活质量或生存率,但移植细胞的活体示踪及进一步的疗效观察一直是面临的难题。本研究采用超顺磁性氧化铁类(ultrasmall superparamagnetic iron oxide/ Ferumoxides、P7228)和顺磁性钆Gd(Ⅲ)离子大分子螯合物(Gd-BOPTA)标记EPCs进行体外MR成像研究,探讨EPCs标记方法及体外MR成像的的最佳参数,为采用EPCs的在体实验研究提供依据。 目的:探讨人脐血内皮祖细胞分离、培养及鉴定的方法,比较不同接种浓度对EPCs生长的影响,得出最佳接种浓度,为EPCs相关实验研究和临床应用搭建平台;探讨Ferumoxides(FE)、P7228和Gd-BOPTA标记EPCs的方法及不同浓度、不同标记时间对细胞活性、粘附、迁移、增殖等生物学特性的影响,明确三者标记EPCs的最佳浓度和标记时间,为下一步实验研究提供依据;探讨Ferumoxides、P7228与Gd-BOPTA标记内皮祖细胞的体外磁共振成像特点,明确标记EPCs的最佳磁性对比剂和最合适的扫描序列,以期为磁性标记EPCs在体内的示踪研究提供理论和实验依据。 材料和方法: 1.人脐血内皮祖细胞的分离、培养、鉴定及生物学特性研究取健康产妇(均知情同意)顺产或剖腹产脐带血,与DPBS1:1稀释,采用密度梯度离心法获取单个核细胞,将其制成不同的浓度接种在人纤维连接蛋白包被的培养瓶中,观察细胞贴壁情况和集落形成情况;培养3天后用PBS液洗掉非贴壁细胞,换培养液继续培养至第7天,以后每隔3天更换培养液,倒置相差显微镜下观察贴壁细胞生长情况。多波长激光共聚焦显微镜鉴定DiI-acLDL和FITC-UEA-1双染色阳性细胞为正在分化的EPCs,流式细胞仪检测其表面标志物进一步鉴定EPCs。采用改良的Boyden Chamber小室、粘附能力测定实验分别观察细胞的迁移能力和粘附能力。 2.人脐血内皮祖细胞Ferumoxides、P7228与Gd-BOPTA标记及标记细胞的生物学特性研究 以多聚左旋赖氨酸(PLL)和jetPEITM-FluoF为介质分别介导FE、P7228和Gd-BOPTA标记EPCs,介质与标记物混合比例为1:0.03,室温下振荡1h,配制的复合物加入培养基中使FE、P7228和GdBOPTA的终浓度为5μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、37.5μg/ml和50μg/ml,相应的介质PLL和jetPEITM-FluoF的终浓度为0.15μg/ml、0.375μg/ml、0.75μg/ml、1.125μg/ml和1.5μg/ml,复合物标记时间分别为24h、48h和72h。采用普鲁士蓝染色、荧光显微镜及透射电子显微镜观察铁颗粒、Gd颗粒在细胞内的位置及不同标记浓度和标记时间条件下的标记率。台盼蓝拒染实验了解标记后细胞的生长活性,采用MTT比色法、改良的Boyden Chamber小室、粘附能力测定实验分别观察标记后细胞的增殖能力、迁移能力和粘附能力。 3.Ferumoxides、P7228与Gd-BOPTA标记的人脐血内皮祖细胞体外MR研究消化、收集未标记和不同浓度的FE、P7228和Gd-BOPTA标记24h的EPCs于1.5mlEP管内,采用SE序列、快速自旋回波序列(FSE)、梯度回波(GRE)序列行MR扫描,测量不同标记物在不同浓度条件下标记的细胞在不同扫描序列中的信号强度变化,以未标记细胞为参照,比较标记细胞的信号变化百分比。 结果: 1.人脐血内皮祖细胞的分离、培养、鉴定及生物学特性研究单个核细胞接种24h后,细胞已有贴壁,细胞呈小圆形,培养3天后贴壁细胞开始变大、透亮度增强并出现梭形细胞。第7天,细胞增殖加快、细胞数量增多、出现较多的梭形细胞和形态均一的细胞增殖集落,至14天,可见细胞呈“铺路石”样排列。其中以2.5×106个/ml的浓度接种培养可获得良好的贴壁细胞数和细胞集落数。第7天,多波长激光共聚焦显微镜鉴定DiI-acLDL和FITC-UEA-1双染色阳性细胞为正在分化的EPC,双染色阳性细胞百分率为95%;流式细胞仪检测表面标志物CD34、AC133、VEGFR2(KDR)的阳性表达率分别为(1.67±0.35%)、(12.63±9.70%)、(66.81±6.63%)。粘附能力和迁移能力检测结果分别为(33.7±1.6)个、(29.2±1.2)个。 2.人脐血内皮祖细胞Ferumoxides、P7228与Gd-BOPTA标记及标记细胞的生物学特性研究 普鲁士蓝染色后显微镜下观察细胞胞浆内可见蓝色颗粒,且随着标记浓度增高和标记时间的延长,细胞内聚集的铁颗粒增多,细胞的标记率也增高,P7228的标记率高于FE ,FE、P7228(浓度为25μg/ml)的12h、24h标记率分别为(91.3±0.59%)、(93.2±0.37%)和(96.7±1.21%)、(97.0±1.1%)。透射电镜观察,胞质内散在分布较多含膜的囊泡样包涵体结构,且囊泡样结构随着浓度增加和标记时间延长相应增多。 荧光显微镜下观察,Gd-BOPTA标记的EPCs胞质内可见绿色荧光颗粒,透射电镜可见胞质内散在分布许多Gd颗粒,颗粒主要位于胞质的胞器如高尔基体周围以及附着在细胞膜内层上。Gd-BOPTA标记规律呈“抛物线”样,即随着标记浓度增高和标记时间的延长,细胞内聚集的Gd颗粒增多,细胞的标记率也增高,但在浓度为25μg/ml标记24h标记率达峰值后,标记率逐渐降低,Gd-BOPTA在浓度为12.5μg/ml、25μg/ml、37.5μg/ml的12h、24h标记率分别(55.7±0.79%)、(80.8±0.51%)、(71.6±0.64%)和(67.4±1.67%)、(88.2±1.56%)、(73.2±2.17%),标记效率低于同条件下的FE和P7228。 FE、P7228和Gd-BOPTA(浓度为25μg/ml、37.5μg/ml和25μg/ml)标记24h后EPCs的细胞活力分别为92.4%、89.5%和93.7%;三种标记物的标记浓度在低于25μg/ml、37.5μg/ml和25μg/ml时,对细胞的粘附能力、迁移能力及增殖能力均无影响(P 0.05)。 3.Ferumoxides、P7228与Gd-BOPTA标记的人脐血内皮祖细胞体外MR研究T1WI序列:浓度增高,FE组、P7228组相对信号强度增大不明显,无显著性差异(P0.05);而Gd-BOPTA组相对信号强度增大明显,最大相对信号强度出现在浓度为25μg/ml时(161%),而后信号降低,与对照管相比差异显著(P0.05)。 T2WI和T2*WI序列:相对信号强度随FE、P7228浓度增加而迅速降低,T2*WI序列上P7228在浓度为50μg/ml时几乎无信号显示。FE、P7228浓度为5μg/ml时,与对照管信号强度差异明显(P0.05),其信号变化率分别为-10.4%、-17.8%和-12.3%、-34.9%。T2*WI上信号变化较T2WI上明显,P7228较FE信号改变更为明显,在T2*WI序列上磁共振信号随FE-PLL、P7228-PLL复合物浓度的增加而降低(r= -0.681、-0.712,P0.05)。与T1WI序列比较,Gd-BOPTA组相对信号强度变化不明显,两种扫描方法所得结果无显著性差异(P0.05)。 结论: 1.采用Ficoll密度梯度离心法结合贴壁筛选法可以较好地分离人脐血EPCs并获得细胞纯度和存活率较高的单个核细胞,细胞功能保持良好,以2.5×106个/ml的浓度接种培养可获得良好的细胞分化和增殖。 2.以PLL为介质的FE、P7228和以jetPEITM-FluoF为介质的Gd-BOPTA均可有效地标记EPCs,在一定的浓度范围内对细胞的生物活性无影响。FE、P7228和Gd-BOPTA的最适标记浓度分别为25μg/ml、37.5μg/ml和25μg/ml,最佳标记时间为24h。 3.FE、P7228、Gd-BOPTA三种MR对比剂皆可简单有效地标记EPCs。FE、P7228对MR信号的影响主要为T2WI和T2*WI效应,T2WI和T2*WI序列对检测超顺磁性氧化铁类具有特异性,可以粗略反映对比剂量的变化,浓度越高T2*WI序列负性效应越明显,以P7228成像效果较佳,T2*WI序列为此类对比剂的最佳磁共振检查序列。顺磁性钆螯合物(Gd-BOPTA)对MR信号的影响主要为T1WI效应,浓度越高正性效应越明显,但信号强度达到最大值后,随着浓度的增加正性效应减弱,说明Gd-BOPTA标记细胞存在最适标记浓度。 4.与顺磁性钆类对比剂相比,超顺磁性氧化铁类对比剂标记细胞方法简单易行,且效果较佳;超顺磁性氧化铁类对比剂中P7228的标记效率高于FE,对标记细胞生物活性的影响较FE小,且MR信号变化较FE敏感,更适合于细胞的标记。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R445.2;R457
【图文】：

血浆血液 单个核细胞淋巴细胞分离液淋巴细胞分离液 红、白细胞图 1-A 图 1-B图 1-1 密度梯度离心法分离单个核细胞。1-A 血液与 Histopaque-1077 淋巴细胞分离液的界面；1-B 离心后脐血单个核细胞的血液分层。

血浆血液 单个核细胞淋巴细胞分离液淋巴细胞分离液 红、白细胞图 1-A 图 1-B图 1-1 密度梯度离心法分离单个核细胞。1-A 血液与 Histopaque-1077 淋巴细胞分离液的界面；1-B 离心后脐血单个核细胞的血液分层。

图 1-5 第 7 天贴壁梭形细胞首尾相接形成的“线样”结构（×200）图 1-6 第 14 天贴壁细胞呈“铺路石”样（×10A 摄取 DiI-acLDL（红色，激发波长 543nm）B 结合 FITC-UEA-1（绿色，激发波长 477nm）

【参考文献】

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本文编号：2770976