靶向纳米脂质超声造影剂评价肝脏储备功能的实验研究

发布时间：2020-08-18 09:38

【摘要】：肝脏是人体新陈代谢的重要器官。目前,肝脏疾病严重危害着人们的健康。肝脏具有很大的代偿能力,早期肝损伤临床表现常不明显。但是,一旦肝脏功能损害严重时常常危及人们的生命。因此,寻求一种能无创监测肝脏功能的医学手段迫在眉睫。 ASGPR是肝实质细胞膜上的特异性受体,其能与末端带半乳糖基的物质发生受体-配体反应,且ASGPR的表达量与肝脏功能密切相关,研究表明,当肝脏功能下降时,ASGPR的含量也相应的减少。国内外学者利用其这一特性,对ASGPR介导的载基因或药物进行了重点研究,取得了巨大的进展。近年来,随着医学分子影像学的飞速发展,影像学专家也积极的寄希望于利用影像学技术及ASGPR的这一特性,对肝脏功能的储备进行评估,这不仅对罹患肝脏疾病拟行手术的患者风险估计有重要意义,且对术后病人的恢复情况也能及时、便捷的掌握。随着超声造影剂的不断发展和超声分子成像的不断推进,我们期望能通过制备肝靶向性超声造影剂,利用超声特有的无创性这一优势,对肝脏储备功能进行在体实时的监测。以往超声对于肝功能的检测方面,常用的包括利用超声造影来评价肝脏血流的区域灌注,用多普勒技术检测超声促发造影剂使微泡破裂后血管内的动力学改变,研究了血流动力学参数与肝脏功能的关系。国外也有学者利用超声多普勒技术,分析肝静脉与门静脉的血流多普勒波形对肝脏功能进行评估。而利用ASGPR受体所介导的肝靶向超声显像,国内外研究甚少。因此,本课题主要从以下三个部分进行了研究: 第一部分中,我们首先制备了靶向肝细胞膜受体ASGPR的配体-半乳糖化多聚赖氨酸,在此基础上分别制备了靶向脂质微泡超声造影剂和液态氟碳纳米脂质超声造影剂,验证了两种靶向超声造影剂的体外寻靶能力。第二部分中,我们研究自制靶向液态氟碳纳米脂质超声造影剂在正常大鼠肝脏靶向性聚集超声显影特性,同时,建立不同程度的大鼠肝损伤模型,利用靶向超声分子显像对比分析各级别大鼠急性肝损伤后峰值回声强度的改变与各级别大鼠急性肝损伤后ASGPR的含量及血清学检查的关系。第三部分中,为了进一步探索该靶向纳米脂质超声造影剂在肝肿瘤领域中的应用,我们研究了普通脂质微泡超声造影剂与自制靶向纳米脂质超声造影剂在兔VX2肿瘤模型中的对比显影特点。目的(1)采用还原胺化法,人工合成去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的配体半乳糖化多聚赖氨酸(GaL-PLL);探讨连接以半乳糖化多聚赖氨酸作为配体的脂质微泡超声造影剂与人肝癌细胞HepG2的靶向结合能力。(2)探讨制备出的肝靶向性液态氟碳纳米超声造影剂的一般特性、与人肝细胞L02的靶向结合及体外聚集显像效果。方法(1)用还原胺化法将多聚赖氨酸进行半乳糖化,制备出去唾液酸糖蛋白受体的靶向配体-半乳糖化多聚赖氨酸。SDS-PAGE蛋白电泳鉴别半乳糖化多聚赖氨酸合成情况,计算出所连接的半乳糖与多聚赖氨酸的量的比例。用葡聚糖凝胶柱G-15分离纯化并收集半乳糖化多聚赖氨酸。在室温下与自制脂质微泡发生化学结合制备成靶向脂质微泡,于荧光显微镜及激光共聚焦下观察体外靶向效果。(2)利用旋转蒸发及声振法制备液态氟碳纳米脂质超声造影剂;培养人肝细胞L02,于不同时间点观察与L02细胞的靶向结合;飞利浦iU 22超声诊断仪L12-5探头对比观察靶向液态氟碳纳米脂质超声造影剂的体外显像效果。结果(1)半乳糖与多聚赖氨酸在摩尔比为1:100,室温下反应24h时,能进行高效连接。靶向脂质微泡粒径平均约为2.05μm,大小较均一;激光共聚焦见HepG2肝癌细胞能与靶向造影剂特异性结合。(2)靶向液态氟碳纳米脂质超声造影剂粒径极小,分布均匀,形态呈圆球形,且能与L02有效结合;体外乳胶囊显示:脱气水侧呈现无回声,靶向液态氟碳纳米脂质超声造影剂侧呈现高回声。结论(1)连接有以半乳糖化多聚赖氨酸为靶向配体的脂质微泡在HepG2肝癌细胞的内吞作用下能与之有效结合。(2)以去唾液酸糖蛋白受体为靶向受体,自制的携半乳糖化多聚赖氨酸的靶向液态氟碳纳米脂质超声造影剂能有效与人肝细胞L02靶向结合,该靶向超声造影剂能在体外聚集显影。该靶向超声造影剂粒径极小,是细胞水平上肝靶向性超声分子显像的一种理想的超声分子探针。目的(1)研究自制靶向液态氟碳纳米脂质超声造影剂在正常大鼠肝脏靶向性聚集超声显影特性,为超声分子成像定量评价肝脏功能提供实验依据。(2)靶向超声分子显像对比分析各级别大鼠急性肝损伤后峰值回声强度的改变与各级别大鼠急性肝损伤后ASGPR的含量及血清学检查的关系。方法(1)建立大鼠肝功能检测指标(总蛋白、白蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶)的标准。健康雄性SD大鼠10只,抽血前一天禁饲,10ml空针分别抽取下腔静脉血2ml置于离心管中,标记并置于4℃冰箱过夜,待其血清成分自然析出后送检。健康雄性SD大鼠10只,经尾静脉团注靶向液态氟碳纳米脂质超声造影剂,注射开始至0.5h内连续观察并记录;0.5h至1h内每10min观察并记录;1h至造影剂消退每30min观察并记录肝实质超声图像。DFY型超声图像定量分析诊断仪对各时间点采集到的超声图像进行分析。 (2)25只健康雄性SD大鼠随机分为5组,根据腹腔灌注四氯化碳(CCl4)分析纯的剂量不同,用食用植物油分别配制浓度为10%、20%、30%、40%及50%的CCl4溶液,每组对应注射1ml的配制溶液,1 d后10ml空针分别抽取下腔静脉血2ml置于离心管中,标记并置于4℃冰箱过夜,待其血清成分自然析出后送检总蛋白、白蛋白、谷草转氨酶及谷丙转氨酶的含量。确定注射剂量后,按相同的方法建模20只,每组4只,1 d后取肝组织分别检测各组中ASGPR的含量,并取肝组织进行扫描电镜观察肝血窦内皮细胞间隙即“窗孔”的改变,TUNEL法检测肝实质细胞的凋亡情况。健康雄性SD大鼠25只,随机分成5组,每组5只,按前述方法建立不同级别的急性大鼠肝损伤模型,实验时常规麻醉,胸腹部备皮,经尾静脉团注靶向液态氟碳纳米脂质超声造影剂,注射开始至0.5h内连续观察并记录;0.5h至1h内每10min观察并记录;1h至造影剂消退每30min观察并记录肝实质超声图像。DFY型超声图像定量分析诊断仪对各时间点采集到的超声图像进行分析。结果(1)正常大鼠血清总蛋白含量为60.0~80.0g/L,白蛋白含量为30.0~50.0g/L,谷草转氨酶含量为0~200U/L,谷丙转氨酶含量为0~50 U/L。自制靶向液态氟碳纳米超声造影剂在正常大鼠肝实质的达峰时间为61.20±4.83min,峰值回声强度为88.20±0.08dB,靶向造影剂消退较缓慢,清除时间为310.00±17.80min。(2)电镜观察到急性肝损伤后肝血窦内皮细胞间隙增大;TUNEL染色发现,随着对实验大鼠注射CCl4的浓度的增加,肝实质细胞凋亡率增加,各组两两对照,差异均具有统计学意义;随着肝损伤程度的增加,肝组织内的ASGPR含量逐渐减少,且各组样本均数两两比较行方差分析,各组样本均数差异均P0.05;随着肝损伤程度的增加,肝靶向超声造影后峰值回声强度逐渐降低,除正常对照组与10%浓度CCl4组P0.05外,其余各组两两比较均P0.05,而达峰时间、清退时间、造影前肝实质回声强度、清退后肝实质回声强度均P 0.05;血清学检查各组总蛋白和白蛋白含量无明显变化,谷丙转氨酶、谷草转氨酶随着肝损伤程度的增加呈现先升高后降低的趋势。结论自制的靶向肝实质细胞膜受体ASGPR的液态氟碳纳米超声造影剂的肝靶向性显影效果佳;不同程度肝损伤后的靶向超声显影结果改变与ASGPR结果改变一致,有利于超声显影定量评价肝脏功能。目的探讨自制的靶向脂质微泡超声造影剂在正常兔肝脏与VX2兔肿瘤模型的超声成像特点,对比研究其与普通脂质微泡超声造影剂超声成像的异同。方法制备靶向脂质微泡超声造影剂与普通脂质微泡超声造影剂,分别从正常兔及VX2肿瘤兔耳缘静脉团注,使用飞利浦iU22超声诊断仪的造影模式,实时监控两种不同造影剂各自的超声显影特点,DFY超声图像定量分析诊断仪分析图像的达峰时间、峰值回声强度、清除时间并对各组参数进行比较。结果在正常兔肝实质,普通脂质微泡超声造影剂(MB)达峰时间明显早于自制的靶向脂质微泡超声造影剂(MB’)达峰时间,峰值回声强度前者高于后者,清除时间前者显著短于后者。在VX2肿瘤区,MB达峰时间明显早于MB’,峰值回声强度前者明显高于后者,清除时间前者显著短于后者。结论自制靶向脂质微泡超声造影剂有其自身独特的超声显像过程和特点,呈“负向显影”模式,且靶向造影剂的达峰时间及清退时间均较普通脂质超声造影剂延迟。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R445.1
【图文】：

蛋白电泳

-1SDS-PAGE蛋白电泳图(A组)

曲线,半乳糖,葡聚糖凝胶柱,吸光度

32-2 葡聚糖凝胶柱 G-15 洗脱曲线：a 为半乳糖吸光度曲线，b 为半乳糖化多聚赖光度曲线1-2 curve of Sephadex G-15: a is the absorbance curve of galactose, b is the abscurve of galactose-polylysine

靶向,脂质,微泡,超声造影剂

-3靶向脂质超声微泡大小较均一，分散较好（400×）

【参考文献】