HIV-TAT PTD结构域介导的SOD_1转导对放射性皮肤损伤的治疗作用及机制研究

发布时间：2017-06-11 09:11

  本文关键词：HIV-TAT PTD结构域介导的SOD_1转导对放射性皮肤损伤的治疗作用及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：第一部分：TAT-SOD1原核表达载体的构建及重组蛋白的表达纯化 目的：超氧化物歧化酶SOD由于具有催化超氧阴离子自由基降解为氧气和过氧化氢的功能，广泛应用于临床常用的皮肤射线防护喷剂中。但普通的SOD1蛋白一方面由于来源于动物血液，存在安全性隐患，另一方面由于分子量大，无法跨越细胞膜进入细胞内，限制了其应用。本研究拟在大肠杆菌中表达融合了蛋白转导结构域（PTD）HIV-TAT及人铜锌超氧化物歧化酶（Gu/Zn SOD, SOD1）的重组蛋白（TAT-SOD1），纯化上述蛋白后验证其蛋白转导作用及入胞后的生物学作用。 方法：合成HIV-TAT结构域的编码序列(YGRKKRRQRRR)及利用聚合酶链反应（PCR）扩增人SOD1编码序列后，插入到原核表达载体pET-28a，由此产生了pET-28a-TAT-SOD1原核表达载体。我们同时构建了不含TAT结构域的pET-28a-SOD1原核表达载体。利用宿主大肠杆菌BL21（DE3）表达重组蛋白，超声破碎细胞后，利用镍-琼脂糖凝胶层析柱纯化后得到了重组TAT-SOD1蛋白。利用免疫荧光试验、SOD酶活试验，超氧阴离子清除试验及总抗氧化能力测定试验验证重组TAT-SOD1蛋白的跨膜作用及跨膜后的生物学活性。 结果：成功构建了pET-28a-TAT-SOD1原核表达载体，导入大肠杆菌后，通过诱导表达纯化，得到了高纯度重组TAT-SOD1蛋白。免疫荧光结果显示重组蛋白能够跨细胞膜进入细胞。SOD酶活试验，超氧阴离子清除试验及总抗氧化能力测定试验结果示，入胞后的重组蛋白仍然保留生物学活性。 结论：通过将原核表达载体pET-28a-TAT-SOD1导入大肠杆菌，表达及纯化得到重组TAT-SOD1蛋白，验证了其跨膜作用及跨膜后的生物学活性。 第二部分：重组TAT-SOD1蛋白对皮肤细胞电离辐射损伤防护作用及机制研究 目的：研究TAT-SOD1对比普通SOD1对人皮肤HaCaT细胞辐射损伤的防护作用及机制，进一步在动物模型上验证TAT-SOD1的辐射保护作用及其机制。 方法：CCK-8实验检测细胞增殖能力的变化；Annexin V-PI双染及Western Blot检测凋亡相关蛋白用于检测电离辐射所致细胞凋亡；DCFH2-DA实验检测细胞内电离辐射诱导的自由基；Mito-Tracker线粒体染色实验检测电离辐射所致线粒体损伤；γH2AX免疫荧光检测DNA双链断裂（DSB）。建立放射性皮肤损伤的SD大鼠模型丙二醛（MDA）及DCFH2-DA用于检测SD大鼠电离辐射损伤后皮肤脂质过氧化及皮肤组织自由基水平。 结果：在20Gy X射线照射后，对比PBS组与普通SOD1组，TAT-SOD1组皮肤HaCaT细胞增殖能力损伤减轻。流式细胞仪分析TAT-SOD1组HaCaT细胞凋亡明显减少；Western Blot表明凋亡相关蛋白Caspase-3，Bax表达明显减少、抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加，提示重组TAT-SOD1蛋白可以明显减轻电离辐射所致皮肤细胞HaCaT的凋亡。TAT-SOD1可以明显减轻X射线所致细胞内明显增加的自由基水平和线粒体损伤。5Gy X射线照射后，TAT-SOD1组DNA双链断裂的数目明显减少，，双链断裂的修复较PBS及普通SOD1组快。动物实验表明，45Gy电子线照射后，SD大鼠皮肤组织的脂质过氧化及自由基水平均明显升高，而TAT-SOD1可以明显抑制电离辐射所致脂质过氧化及活性氧水平。 结论： TAT-SOD1能够明显减轻电离辐射所致HaCaT细胞损伤，并且能够减少SD大鼠电离辐射照射后皮肤组织的活性氧及脂质过氧化水平，为放射性皮肤损伤的救治提供了新的治疗策略。
【关键词】：铜锌超氧化物歧化酶 蛋白转导结构域 HIV-TAT结构域 原核表达 电离辐射诱导皮肤损伤 细胞增殖能力 细胞凋亡 自由基 线粒体损伤 DNA双链断裂 脂质过氧化
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R818
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 引言10-16
• 参考文献12-16
• 第一部分 TAT-SOD1原核表达载体的构建及重组蛋白的表达纯化16-41
• 前言16-17
• 材料和方法17-31
• 一、 材料与仪器17-19
• 二、 实验方法19-31
• 结果31-36
• 一、 pET28a-TAT-SOD1原核表达载体的鉴定31-33
• 二、 重组载体 pET28a-TAT-SOD1在 E.coli BL21（DE3）中的融合表达及SDS-PAGE 电泳鉴定33
• 三、 TAT 介导的融合蛋白 TAT-SOD1的入胞效应33-34
• 四、 TAT-SOD1跨膜后的生物学活性检测34-36
• 讨论36-38
• 参考文献38-41
• 第二部分 重组 TAT-SOD1蛋白对皮肤细胞电离辐射损伤防护作用及机制研究41-68
• 前言41-42
• 材料和方法42-53
• 一、 实验材料与仪器42-44
• 二、 实验方法44-53
• 结果53-62
• 一、 细胞水平研究 TAT-SOD1对放射性皮肤损伤的防护作用53-61
• 二、 动物水平研究 TAT-SOD1对放射性皮肤损伤的防护作用61-62
• 讨论62-64
• 参考文献64-68
• 本文研究结果及结论68-69
• 综述69-88
• 参考文献78-88
• 缩略词表88-90
• 攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文90-91
• 致谢91-92

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本文编号：441273