肝素—超氧化物歧化酶结合物（Hep-SOD）防治辐射损伤作用的研究

发布时间：2017-06-10 19:15

  本文关键词：肝素—超氧化物歧化酶结合物（Hep-SOD）防治辐射损伤作用的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：随着医疗技术的快速发展,日益精密先进的放射疗法在肿瘤治疗领域发挥着举足轻重的作用。然而,肿瘤周围的正常组织损伤始终是一个无法根本克服的难题,很大程度上阻碍了放疗的进一步深化应用。为了有针对性地研究出高效低毒的辐射保护剂,首先需要了解辐射损伤的产生机理。目前被广泛接受的是一种氧化应激损伤学说,该学说认为辐射作用于机体后,诱导体内产生过量活性氧类物质(reactive oxygen species, ROS),后者靶向损害DNA、脂质、蛋白质等生物大分子进而引起相关组织功能异常,产生损伤效应。其中,ROS家族包含了多个成员,超氧自由基(superoxide radical, O2)最先产生并通过后续反应可诱发多种其它ROS。可见,清除O2-缓解辐射损伤起着关键作用。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)是体内唯一特异性歧化O2-的酶,但是其直接药用存在易降解、稳定性差、半衰期短等不足。为提高此类酶类药物在体内的生物利用度,化学修饰是常用的方法之一。我们在此采用功能性黏多糖肝素作为修饰剂,旨在改善蛋白质药物的自身不足,同时也能整合多种生物学功能,从而协同其药效的发挥。本课题中,我们借鉴前人研究基础,先后分离纯化SOD原料并制备出肝素修饰SOD结合物(Hep-SOD)。通过SDS-PAGE、Native-PAGE、SEC-HPLC、连苯三酚自氧化速率测定法及凝胶渗透色谱-多角度激光散射技术检测SOD及Hep-SOD的纯度、酶比活、分子量等。运用优化的MTT法于体外初步评价Hep-SOD对小鼠肺成纤维细胞L929的辐射防护作用。采用总SOD测试盒检测小鼠外周血中酶活性和Hep-SOD的基本药代动力学参数。参考抗辐射药物的临床前试验指导原则,在小鼠全身水平开展Hep-SOD对辐射损伤防护作用的体内评价。 1.猪血SOD原料的分离纯化 借鉴前人研究基础,采用DEAE-Sepharose Fast Flow对猪血SOD原料进行分离纯化。联合SDS-PAGE和SEC-HPLC对SOD纯化产品进行纯度的定性和定量检测。结果表明DEAE-Sepharose Fast Flow一步法可将SOD的纯度由87%提高到100%左右。联合BCA蛋白定量和微量连苯三酚自氧化速率法测定活性,纯化后SOD的酶比活由3076u/mg prot提高到4614u/mg prot。 2.肝素修饰SOD结合物(Hep-SOD)的制备及其纯度和分子量的测定 借鉴前人研究基础,先后经过肝素活化、结合反应及Q-Sepharose Fast Flow分离纯化制备Hep-SOD。采用三硝基苯磺酸法(TNBS法)检测出SOD的平均自由氨基修饰率为32%。通过SDS-PAGE和Native-PAGE检测,发现分离纯化出两种修饰率不同的Hep-SOD,分别为Hep-SOD1和Hep-SOD2。与未修饰SOD相比,Hep-SOD1酶比活保留率为68%,Hep-SOD2的酶比活保留率为40%。借助凝胶渗透-多角度激光散射技术,测得两者的重均分子量(Mw)分别为49.69kDa和61.07kDa。 3. Hep-SOD对小鼠L929细胞辐射防护作用的体外评价 先后对L929细胞接种密度、产生敏感性照射剂量及照射后检测时间进行筛选,结果表明L929按每孔2000个细胞进行接种,于照后48h进行MTT检测,可对4Gy的X射线产生显著的辐射敏感性。同时,Hep-SOD用药剂量的筛选结果显示：可能源于较高的肝索修饰率,Hep-SOD2的安全剂量范围较窄,仅在500～0μg/ml(即112.5～0U/m1)范围无细胞毒作作用；而Hep-SOD1在考察的剂量范围1000～0μg/ml(即990～0U/m1)内均无细胞毒作用。为方便比较,我们统考察112.5U/ml的Hep-SOD1和Hep-SOD2分别在照前给药和照后给药对L929细胞的辐射防护作用。结果表明：二者照前给药的防护作用突出,相对细胞活力与正常对照组相比无显著差异；而照后给药则无此作用。 4. Hep-SOD在小鼠体内基本药代动力学参数的测定 对小鼠采用腹腔注射，，于给药后不同时间点采血,利用总SOD测试盒检测小鼠外周血中酶活性,并结合相关软件分析。结果表明：Hep-SOD在小鼠体内药动学行为符合二室模型；Hep-SOD1和Hep-SOD2较术修饰SOD体内半衰期均显著延长,尤其是Hep-SOD2的平均滞留时间(MRT)由SOD的(10.28±0.98)h显著延长到了(22.86±3.37)h,表现出更高的生物利用度逆。 5. Hep-SOD对小鼠辐射防护作用的体内评价 基于Hep-SOD体外评价和基本药代动力学参数的测定结果,在此着重选择具备一定辐射防护效果和较高生物利用度的Hep-SOD2(为简便起见,下文更换名称为Hep-SOD)进行本章的体内药效评价。具体参考抗辐射药物的临床前试验指导原则,系统考察Hep-SOD在受照小鼠全身水平的辐射防护作用。结果显不：Hep-SOD可有效缓解辐射诱发的骨髓抑制；预防组织器官(尤其是肺组织)的氧化应激损伤；阻止辐射导致的外周血谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)的异常升高；减轻小鼠肝组织、肺组织及小肠组织的结构病变；整体表现较好的辐射损伤防护作用。但胸腺DNA琼脂糖凝胶电泳结果显示照前给药有加剧DNA损伤的可能。综上可知,我们对辐射损伤的产生和Hep-SOD防护作用机理的认识还有待进一步加深。 本研究取得结果和结论： (1)运用凝胶渗透-多角度激光散射光谱技术测得Hep-SOD重均分子量。 (2) Hep-SOD于照射前给药对小鼠肺成纤维细胞L929可表现较好的辐射损伤防护作用。 (3)SOD经肝素化修饰后体内保留时间显著延长,生物利用度明显提高；且随其自由氨基修饰率的提高,Hep-SOD表现更好的药代动力学性质。 (4)在小鼠辐射损伤模型试验中,Hep-SOD可有效减轻辐射诱发的骨髓抑制,缓解肝组织和肺组织的氧化应激损伤,且抑制肝、肺和小肠的病理形态变化。但是,结果同样显示Hep-SOD照射前给药可能加剧DNA损伤,这为我们全面研究辐射损伤的产生及Hep-SOD的作用机制指明了新的方向。
【关键词】：超氧化物歧化酶 肝素 肝素-超氧化物歧化酶结合物 凝胶渗透-多角度激光散射光谱技术 MTT检测 药代动力学参数 辐射损伤
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R818.05;R96
【目录】：

• 摘要16-19
• ABSTRACT19-23
• 符号说明23-26
• 第一章 前言26-39
• 1 活性氧类物质(reactive oxygen species,ROS)26
• 2 辐射与辐射损伤26-28
• 3 辐射保护剂的研究28
• 4 超氧化物歧化酶(SOD)及其辐射保护作用的研究28-34
• 4.1 超氧化物歧化酶28-30
• 4.2 SOD的辐射保护作用研究30-34
• 4.2.1 组织或器官水平的辐射保护作用30-31
• 4.2.2 细胞水平的辐射保护作用31-33
• 4.2.3 分子水平的辐射保护作用33-34
• 5 超氧化物歧化酶的自身局限性与解决办法34-35
• 5.1 SOD的自身局限性34
• 5.2 改善SOD不足的解决办法34-35
• 5.2.1 转基因治疗34
• 5.2.2 非肽模拟类似物34-35
• 5.2.3 化学修饰35
• 6 肝素修饰SOD的可行性35-38
• 6.1 肝素的生物活性35-37
• 6.1.1 抗血栓36
• 6.1.2 抗炎36-37
• 6.1.3 降血脂37
• 6.1.4 抗癌37
• 6.1.5 抗氧化37
• 6.2 前期研究基础37-38
• 7 本课题拟解决问题38-39
• 第二章 超氧化物歧化酶原料的分离纯化39-48
• 1 材料39-40
• 1.1 试剂39
• 1.2 仪器39-40
• 2 方法40-42
• 2.1 DEAE-Sepharose Fast Flow凝胶色潜柱对SOD的分离纯化40
• 2.2 样品的超滤脱盐40
• 2.3 SOD的SDS-PAGE检测40-41
• 2.4 SOD的SEC-HPLC检测41
• 2.5 SOD的蛋白质含量测定41
• 2.6 SOD的酶活测定41-42
• 3 结果42-45
• 3.1 SOD的分离纯化42-43
• 3.2 SOD的SDS-PAGE分析43
• 3.3 SOD的SEC-HPLC检测43-44
• 3.4 SOD的酶活检测44-45
• 4 讨论45-47
• 4.1 SOD的分离纯化45
• 4.2 蛋白含量测定方法的选择45-46
• 4.3 酶活测定方法的选择46-47
• 5 结论47-48
• 第三章 肝素-超氧化物歧化酶结合物(Hep-SOD)的制备及其纯度与分子量的测定48-61
• 1 材料48-49
• 1.1 试剂48
• 1.2 仪器48-49
• 2 方法49-51
• 2.1 肝素的活化49
• 2.2 肝素与SOD的结合反应49
• 2.3 SOD平均自由氨基修饰率的测定49
• 2.4 Q-Sepharose Fast Flow凝胶色谱柱对Hep-SOD的分离纯化49-50
• 2.5 样品的超滤脱盐50
• 2.6 Hep-SOD的电泳检测50
• 2.7 Hep-SOD的分子量检测50-51
• 2.8 Hep-SOD的酶活测定51
• 3 结果51-57
• 3.1 SOD平均自由氨基修饰率51
• 3.2 修饰反应液的电泳检测51-52
• 3.3 修饰反应液的分离纯化52
• 3.4 修饰反应液分离纯化产物的Native-PAGE52-53
• 3.5 Hep-SOD分子量测定53-57
• 3.5.1 纯化SOD的多角度激光散射图谱53-54
• 3.5.2 肝素的多角度激光散射图谱54-55
• 3.5.3 Hep-SOD的多角度激光散射图谱55-57
• 3.6 Hep-SOD酶活测定57
• 4 讨论57-60
• 4.1 肝素对SOD的化学修饰57-58
• 4.2 Hep-SOD的分离纯化58-59
• 4.3 肝素化修饰对SOD活性的影响59
• 4.4 Hep-SOD分子量分布59-60
• 5 结论60-61
• 第四章 肝素-超氧化物歧化酶结合物(Hep-SOD)辐射防护作用的体外研究61-69
• 1 材料61-62
• 1.1 试剂61
• 1.2 细胞株61
• 1.3 仪器61-62
• 2 方法62-64
• 2.1 L929细胞的传代及培养62
• 2.2 MTT法评价Hep-SOD对L929细胞的辐射防护作用62-64
• 2.2.1 细胞接种密度、敏感性照射剂量及照后检测时间的筛选62
• 2.2.2 Hep-SOD用药剂量的筛选62-63
• 2.2.3 Hep-SOD对L929细胞辐射防护作用的评价63-64
• 2.2.3.1 照前给药作用评价63
• 2.2.3.2 照后给药作用评价63-64
• 2.3 数据处理64
• 3 结果64-68
• 3.1 细胞接种密度、敏感性照射剂量及照射后检测时间的筛选64-65
• 3.1.1 照后24h检测结果64
• 3.1.2 照后48h检测结果64-65
• 3.2 药物剂量的筛选65-66
• 3.3 药物辐射防护作用评价66-68
• 4. 讨论68
• 5 结论68-69
• 第五章 肝素-超氧化物歧化酶结合物(Hep-SOD)基本药代动力学参数的测定69-74
• 1 材料69-70
• 1.1 试剂69
• 1.2 仪器69
• 1.3 动物69-70
• 2 方法70
• 2.1 抗凝EEP管制作70
• 2.2 动物分组、给药及取血70
• 2.3 小鼠外周血浆酶活测定70
• 2.4 数据处理70
• 3 结果70-72
• 4 讨论72
• 5 结论72-74
• 第六章 肝素-超氧化物歧化酶结合物(Hep-SOD)防治辐射损伤体内药效评价74-88
• 1 材料74-75
• 1.1 试剂74
• 1.2 仪器74-75
• 1.3 动物75
• 2 方法75-77
• 2.1 动物分组75
• 2.2 小鼠急性辐射损伤模型75
• 2.3 生化指标测定75-76
• 2.3.1 器官指数75
• 2.3.2 造血功能指标75-76
• 2.3.2.1 脾结节(CFU-S)计数75
• 2.3.2.2 骨髓有核细胞(BWNC)计数75
• 2.3.2.3 骨髓DNA含量测定75-76
• 2.3.3 外周血象计数76
• 2.3.4 肝功检测76
• 2.3.5 组织抗氧化能力检测76
• 2.3.6 胸腺DNA琼脂糖凝胶电泳76
• 2.3.6.1 胸腺DNA的提取76
• 2.3.6.2 DNA琼脂糖凝胶电泳76
• 2.3.7 病理切片观察76
• 2.4 数据处理76-77
• 3 结果77-84
• 3.1 器官指数77
• 3.2 造血功能77-78
• 3.3 外周血象计数78-79
• 3.4 肝功检测79
• 3.5 组织抗氧化能力检测79-81
• 3.5.1 MDA检测79-80
• 3.5.2 GSH检测80-81
• 3.6 胸腺DNA琼脂糖凝胶电泳81-82
• 3.7 组织病理切片观察82-84
• 3.7.1 肝组织病理切片观察82-83
• 3.7.2 肺组织病理切片观察83-84
• 3.7.3 小肠组织病理切片观察84
• 4 讨论84-87
• 4.1 Hep-SOD对骨髓抑制的调控84-85
• 4.2 Hep-SOD对氧化应激的调控85-86
• 4.3 Hep-SOD对肺损伤的保护作用86-87
• 5 结论87-88
• 全文总结88-89
• 参考文献89-104
• 致谢104-105
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文105-106
• 学位论文评阅及答辩情况表106

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 黄寿吾,李惜光,杨春雷;肝素抗凝血和抗血栓作用机理研究的某些进展[J];国外医学.输血及血液学分册;1996年02期

2 朱敏恒,吴越;动脉粥样硬化发生机制的若干研究进展[J];农垦医学;2002年03期

3 常雅宁,王志友,刘金秀,杨昭鹏,谭华;两种连苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶的比较[J];药物分析杂志;2001年05期

4 齐敬总;王凤山;张鸿伟;曹吉超;张天民;;低分子肝素修饰超氧化物歧化酶及修饰酶的理化性质研究[J];中国药学杂志;2006年02期

5 袁勤生;;超氧化物歧化酶的分析测定[J];中国医药工业杂志;1989年10期

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