脑胶质瘤酰胺质子转移磁共振成像与组织病理学及基因组学相关研究

发布时间：2017-07-30 08:18

  本文关键词：脑胶质瘤酰胺质子转移磁共振成像与组织病理学及基因组学相关研究

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【摘要】：研究背景胶质瘤是成人最常见的原发性脑肿瘤,儿童最常见的脑肿瘤。近年来,尽管外科手术、放疗及化疗等治疗手段取得了一定的进展,但预后没有明显的改善。以个体基因信息为基础的精准医疗成为恶性胶质瘤治疗研究的最新热点,但仍处于初步探索阶段。世界卫生组织(WHO)分级的III级胶质瘤患者通常有2-3年生存期,而Ⅳ级胶质瘤患者仅有12-15个月的生存期。当前胶质瘤的影像诊断面临的主要难题是术前胶质瘤的鉴别诊断(例如与颅内原发淋巴瘤鉴别)、胶质瘤分级以及恶性胶质瘤随访过程中准确鉴别肿瘤复发、假性进展及放射性坏死。准确的诊断对于治疗方案的制定及患者生存期的延长有决定性作用。目前,临床上仍然以活检病灶组织的病理诊断结果作为“金标准”。而公认的是磁共振成像技术是诊断和评估胶质瘤最重要的影像学方法,对病理诊断有重要的补充意义,但是常规MRI技术多局限于仅仅提供解剖学信息,未能提供更多病灶生物学分子水平的信息,更严重的是新近发现MRI钆剂造影剂会在小脑齿状核及基底节区中沉积,美国FDA已预警钆剂在人脑沉积的健康风险。因此发展内源性的分子水平MRI成像技术对于脑胶质瘤患者的诊治迫在眉睫。酰胺质子转移(Amide Proton Transfer, APT)成像是一种特殊类型的化学交换饱和转移(Chemical Exchange Saturation Transfer, CEST)磁共振成像技术,能探测活体中内源性的位于细胞质内游离的蛋白质及多肽。前期实验室结果表明,APT成像可提供重要的反映胶质瘤组织中过度表达的蛋白及多肽的信息,这一结果与脑胶质瘤患者MRI介导的蛋白组学及活体MR波谱的结果一致。本论文研究了APT成像在恶性胶质瘤临床诊断和治疗过程中的应用,包括胶质瘤与原发性中枢性淋巴瘤的术前鉴别诊断以及引导立体定位活检胶质瘤的应用以及相关组织病理学做了深入的研究,并将APT成像特征与基因表达水平联系的影像基因组学做了初步探讨,希望不仅能从病理、基因水平更好地理解APT成像机制,而且能将APT成像技术从目前简单的影像学诊断推广到能为外科手术和基因靶向药物等临床治疗方案的选择提供更有意义的分子生物学水平信息。一、应用酰胺质子成像鉴别原发性中枢神经系统淋巴瘤和高级别胶质瘤目的：应用APT加权(APT-weighted, APTW)成像鉴别诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤(Primary Central Nervous System Lymphoma, PCNSL)与高级别胶质瘤(High-grade Glioma, HGG)。同时研究APTW信号强度与肿瘤细胞核浆比(Nucleus/Cytoplasm Ratio, N/C)之间的相关性。方法：1.受试者录用及MR成像扫描经手术切除或立体定向穿刺活检病理证实的11例PCNSL(共13个病灶)患者和21例HGG患者在治疗前行常规磁共振序列(T1W、T2W、FLAIR和Gd-T1W)及APT序列扫描。MRI常规图像确定病灶实质部分最大截面,对该层面进行APT成像,获得偏置范围在±6ppm之间的Z谱和15.6ppm处的传统的与组织中类固体相关的磁化转移率(Magnetization Transfer Ratio, MTR)。2. APTw图像处理所有的原始图像数据用交互式数据语言(IDL; ITT Visual Information Solutions, Boulder, CO, USA)进行分析。APTW数据首先进行B0不均匀性校正,APTW图像用校正后的频率偏置在±3.5ppm的数据进行计算:MTRasym(3.5ppm)= Ssat(-3.5 ppm)/S0-Ssat(+3.5 ppm)/S0。此方程中Ssat和So分别指代有或没有选择性射频发射时图像的信号强度。考虑到相对于MTRasym(3.5ppm)在-3.5ppm偏置处可能存在的奥氏核效应(]nuclear Overhauser effect, NOE),计算得出的MTRasym(3.5ppm)通常被称为APT加权(APTW)图像。3.影像学参数测量两位影像医师独立勾画感兴趣区(Region of Interest, ROI),勾画ROI时参考T1W增强图像,ROI均尽量避开肿瘤坏死区域及肿瘤血管,对于每例病灶,在钆剂增强范围内至少勾画5个ROI。记录每个病灶对应的最大APTW信号值(APTWmax)、最小APTW信号值(APTWmin),病灶内APTW值分布值(APTWmax-min)和APTW平均值(APTWmean),总化学交换饱和转移信号CESTtotal和MTR值,同时测量瘤周水肿区的APTW值和MTR值。CESTtotal和MTR值在对应于测量APTWmax的ROI处采集。4.组织病理学数据分析在每张HE切片中选择热点区域于200倍视野下拍摄数码照片。热点区域为尽量避免非肿瘤成分(肿瘤血管,坏死区域,浸润的炎症细胞和组织切片伪影)的肿瘤实质部分。然后应用图片分析软件Image-Pro Plus分析热点拍摄的数码照片。病理医师在程序中分别选择蓝染的细胞核和红染的细胞浆定义细胞核和细胞浆,该软件把待测图像进行选定的颜色分离后而计算出各自颜色对应的总面积。核浆比由细胞核总面积除以细胞浆总面积得出。5.统计学处理采用组内相关系数(Intraclass Correlation Coefficient, ICC)检验两观察者获得的两组图像测量数据结果一致性。应用独立样本t检验分析PCNSL和HGG两组的肿瘤实质区的APTWmax、APTWmin、APTWmax-min、APTWmean、CESTtotal和MTR值以及瘤周水肿区APTW、MTR值均数的差异是否有统计学意义,并通过受试者工作特征曲线(Receiver Operating Characteristic Curve, ROC曲线)分析肿瘤实质中上述测量值中具有统计差异的影像学参数在PCNSL和HGG两组肿瘤之间的鉴别诊断能力。采用简单线性回归分析APTWmax值、MTR值与核浆比之问的关系。取P0.05为差异有统计学意义。结果：1. PCNSL和HGG的平均MTRasym谱线显示水共振信号下游3.5ppm偏置处可见较强的CEST效应。PCNSL和HGG肿瘤实质区的APT效应较对侧正常表现脑白质明显。2.在APTW图像上PCNSL通常显示为相对均匀一致的高信号(相对于病灶同层面对侧正常表现的脑白质信号为高信号)。对比HGG肿瘤实质部分,在PCNSL肿瘤实质部分的APTWmax, APTWmax-min和CESTtotal显著降低(p分别小于0.05,0.01,和0.05),而APTWmin和MTR值显著增高(两者p值均小于0.01)。PCNSL的瘤周水肿区的APTW值较HGG明显减低。在鉴别PCNSL和HGG两组肿瘤时,上述诸影像参数中APTWmax-min具有最大的曲线下面积(AUC=0.963)。3.在本实验部分中PCNSL的核浆比较HGG明显升高(1.69±0.72 vs.0.55±0.21,P0.01)。APTWmax与核浆比之间存在明显的负相关关系(R=0.576,P0.01),但在MTR与核浆比之间则为中等正相关关系(R=0.326,P0.084)。结论：以蛋白质浓度为基础的APTW信号是一种有临床应用价值的磁共振生物学标记物,对术前鉴别PCNSL和HGG有重要作用。结果证实了APTw信号主要来源于组织中的游离的蛋白质和多肽。二、APTw图像引导立体定向活检与组织病理学分析评估APTw信号作为新诊断胶质瘤的影像学生物标记物目的：通过APTw图像引导定向活检技术,将活检组织的病理结果与APTw信号改变进行“点对点”分析,评估APTw高信号作为恶性胶质瘤的影像学生物标记物的可行性。方法：1.患者入选标准本部分试验为前瞻性研究,24例临床根据病史、体征和常规MR图像治疗,临床怀疑为胶质瘤且未经治疗,术前短期内经APT序列扫描,手术病理确认为胶质瘤的患者入选本实验。所有受试者APT扫描后行应用神经导航定向系统介导立体定向活检术。APT成像扫描与手术间隔时间除一例(15天)外均少于6天。2.MR成像采集技术病人在3 T磁共振上扫描。此部分研究采用三维APT全脑扫描方案,包括射频饱和脉冲、脂肪抑制、三维梯度自旋回波成像采集等三部分。常规MRI序列包括T1W、T2W、FLAIR和Gd-T1W。3. APTw图像处理为了减少在扫描过程中可能出现的运动伪影,采集的原始APTw数据系列首先通过3.5ppm偏置处的饱和图像校准。此校准过程由功能神经影像软件(AFNI)完成。然后,根据之前计算的WASSR B0不均匀性图像,APTw数据进行频率偏置移位,从而校正APTw数据中可能的B0不均匀性。APTw图像用校正后的频率偏置在±3.5ppm的数据进行计算,MTRasym(3.5 ppm)。4.立体定向活检在每个病灶中选定3到6个ROI来采样活检组织,优先考虑病灶内的APTw高信号区和钆剂强化区重叠的区域为活检目标。在缺乏明显APTw高信号或钆剂增强的病灶中,则在T2/FLAIR高信号区内选取手术路径最可行的ROI作为活检目标。ROI在BrainLab神经导航系统中被标记在共校准的临床MR图像上。应用术中导航技术,术中实际精确的活检部位被实时标注在BrainLab截屏图像上。最后经导航获取的活检组织保存固定于4%的福尔马林中待进一步病理分析。5.病理学参数半定量及定量分析两位神经病理医师(盲向于对影像特征和活检部位)于HE切片上半定量分析肿瘤分级(Grade),肿瘤细胞密度(Cell_ove和Cell_hot)和坏死程度(Nec_ove和Nec_hot)并转换成对应的有序分类变量。每份样本都经过两个不同观测范围的评估：整体观(对应“ove”)和局部热点区(对应“hot”)。定量分析绝对肿瘤细胞密度(Cell_count)和增殖指数(Ki-67)。通过图像处理软件ImageJ分析在热点区拍摄的数码相片,运用“粒子分析”的插件功能半自动计算细胞密度Cell_count,单位为个/视野。增殖指数(Ki-67)的计数在Ki-67免疫组化染色切片上进行评估。计数热点区Ki-67阳性染色的肿瘤细胞核所占整个视野内总的肿瘤细胞核的百分数得出增殖指数。6.测量APTw值将每个靶向活检位点标记到配准后的实验用常规MR图像上,再将活检位点定位到3.5ppm偏置处饱和的Ssat配准后图像,神经影像科医师在位点处手动勾画包括4到5个体素的ROI,同时也选取同层面的对侧正常表现脑白质作为APTw值校正参考。最后将上述ROI内的绝对APTw信号值减去对侧CNAWM的APTw值,并记录下来作为对应ROI的APTw强度。7.统计分析应用Pearson's或者Spearman's相关分析评估APTw信号强度和各个病理指数之间的相互关系,设置统计显著性水平为p0.05。病理诊断为不同WHO肿瘤级别Grade(Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级)的样本之间的APTw信号强度的均数差异由单因素方差分析检验,然后采用LSD检验APTw强度的两两组间比较是否有差异。应用两独立样本t检验分别分析高级别胶质瘤(WHO分级Ⅲ级和Ⅳ级)与低级别胶质瘤(WHO分级Ⅱ级)两组样本组织之间的APTw强度均数是否有差别,以及高级别胶质瘤和低级别胶质瘤两组患者之间的APTwmax强度均数是否有差别。为分析APTw信号的病理预测因子,将一组病理学预测变量(Grade、Cell_ove、Cell_hot、Nec_ove、Nec_hot和Ki-67)输入以APTw信号强度为独立变量的多重线性回归模型分析中。应用ROC曲线进一步评估应用APTw或APTwmax信号强度鉴别高级别样本区与低级别样本的诊断能力。结果：1.实验共收集70份新诊断胶质瘤的组织样本。根据WHO标准,33份组织诊断为Ⅱ级胶质瘤,14份组织为Ⅲ级胶质瘤,15份标本为Ⅳ级胶质瘤,8份样本被诊为瘤周水肿组织。在6例病灶中发现同时存在多重级别的胶质瘤成分。24例患者中有21例立体定向活检后随即接受肿瘤切除术,基于肿瘤切除术中采样组织得出的最终病理结果与根据术中立体定向活检组织得出的最终病理结果一致。2.不管高级别胶质瘤病灶是否显示钆剂强化在APTw图像上都一致性地表现为APTw高信号病灶,低级别胶质瘤则显示为等一稍高APTw信号。3. APTw信号强度分别与样本的病理分级Grade (R= 0.572, p 0.001),绝对细胞密度Cell_count (R= 0.757, p 0.001)以及增殖指数Ki-67(R=0.538,p0.001)存在显著强正相关关系。4.多重线性回归分析显示APTw信号强度主要受肿瘤组织细胞密度(Cell_count)和增殖指数Ki-67的影响。ROC分析证实APTw信号强度能够很好地区分高级别胶质瘤组织和低级别胶质瘤组织(APTw阈值为2.74%,AUC为0.804)。结论：APT信号是一种能反映恶性胶质瘤组织病理特征的、有价值的影像学生物标记物,尤其在异质性明显的胶质瘤内部来定位局部高级别的肿瘤组织,有重要作用。APTw成像引导的立体活检术能提高活检取材准确性。三、酰胺质子转移成像鉴别恶性胶质瘤肿瘤复发和放射性坏死的临床价值目的：在APTw图像引导下,对术后疑似复发恶性胶质瘤患者的进行立体定向活检,评估APTw成像鉴别恶性胶质瘤肿瘤复发和放射性坏死的价值。方法：1.患者入选标准本部分试验为前瞻性研究,收集21例临床怀疑恶性胶质瘤复发的患者,APTw扫描前都行手术切除术、术后标准放疗和化疗。所有受试者APT扫描后短期行应用神经导航定向系统介导立体定向活检术或肿瘤切除术。APT成像扫描与手术间隔时间除一例(25天)外均少于6天。2.MR成像采集技术及APTw图像处理患者经3.0T磁共振扫描仪上行三维APTw全脑扫描,每个患者经Tlw、T2w、FLAIR、钆剂增强T1w和APT成像序列扫描。MR成像采集技术和APTw图像处理的具体细节参照第二部分。3.立体定向活检具体操作方法和设备同第二部分。优先考虑病灶内的APTw高信号区和钆剂强化区重叠的区域为活检目标,如果APTw信号没有明显增高则从钆剂强化区采样。4.病理学参数半定量及定量分析具体操作方法,设备试剂和病理半定量分析方法同第二部分。在HE切片在热点区域观察的细胞密度、坏死程度分别记录为Cell_hot和Nec_hot。通过观察切片整体得出的细胞密度、坏死程度分别记录为Cell_ove和Nec_ove。并新增加肿瘤状态这一病理指标,肿瘤状态分为三个等级：休眠、混合以及活跃,肿瘤状态评估的指标包括核异型性,有丝分裂,增值程度,肿瘤血管形成情况以及坏死的形态等。5. APTw图像分析图像配准细节以及APTw信号ROI勾画方法参照论文第二部分。6.统计分析采用单因素方差分析在三组不同的肿瘤状态(休眠、混合以及活跃)之间分析病理指标以及APTw信号强度的差异有无统计意义,分别采用LSD检验或Wilcoxon-Mann-Whitney法验证两两组间的各指标是否有差异。应用Pearson's, Spearman's或者Kendall's相关分析方法分析APTw信号强度和各个病理指标之间以及各个病理指标两两之间的相关关系。用独立样本t检验验证肿瘤复发和放射性坏死之间的APTw信号均数的差别。最后用多重线性分析模型寻找能解释并预测APTw信号强度的病理指标,预测因子变量包括肿瘤状态,Cell_ove, Cell_hot, Nec_ove, Nec_hot, Cell_count和Ki-67,输入标准水平设置为p0.05。结果：1.共计从21例怀疑恶性胶质瘤复发患者中收集到64份活检样本。35份活检样本被定义为活跃,13份为休眠,12份为混合,8份样本被诊为瘤周水肿组织。21例患者中发现有9例患者单一病灶来源的多块活检样本同时出现两种以上的肿瘤状态。21例患者中有19例立体定向活检后立即行肿瘤切除术,基于肿瘤切除术中取得的样本得出的病理结果与根据术中立体定向活检组织得出的病理结果一致。2.休眠组织的平均APTw信号强度为1.22±0.60%,混合组织为1.97±1.04%,活跃组织为3.14±0.68%,组内和组间差异均有统计学差异。3.本实验将休眠样本和混合样本合并为放射性坏死组,活跃肿瘤状态的样本被定义为肿瘤复发。肿瘤复发组和放射性坏死组的APTw信号强度分别为3.14±0.68%和1.61±0.93%(p0.001)。ROC评估APTw信号强度区分放射性坏死和肿瘤复发的诊断效能,显示APTw信号强度大于2.37%(阈值)时将肿瘤复发组织从放射性坏死组织中鉴别出来即有85.7%的敏感性,84.0%的特异性,AUC为0.891。4. APTw信号与肿瘤状态、Cell_ove、Cell_hot、Cell_count、Ki-67呈显著正相关关系,APTw信号信号强度与坏死程度(Nec_ove或Nec_hot)之间仅仅存在非常弱的负相关关系。5.多重线性回归分析显示在术后恶性胶质瘤疑似肿瘤复发的病灶中,肿瘤状态是APTw信号强度可信的有效的预测因子。结论：APTw图像高信号是恶性胶质瘤的影像标记物,APTw成像可帮助鉴别肿瘤复发与放射性坏死。APTw高信号可能反映复发恶性胶质瘤病灶内最恶性的成分。四、多形性胶质母细胞的影像基因组学初探：酰胺质子转移成像和信使RNA表达量的关系目的：初步探讨多形性胶质母细胞瘤的APTw影像学特征与病灶mRNA表达量之间的关系,旨在寻找出GBM不同APTw影像特征之间的mRNA表达差异基因及模块。方法：1.受试者资料及磁共振扫描GBM患者16例,APT扫描之前未经手术、放疗、化疗或激素治疗的免疫功能完整的患者。患者经3T磁共振扫描仪上行APTw扫描及传统MRI序列扫描(T1w、T2w、FLAIR和钆剂增强Tlw),MR成像采集技术及APTw图像处理具体细节参照第一部分。2.组织样本获取方法APTw信号强度≥1.57%同时合并钆剂增强的肿瘤区域被定义为肿瘤实质区,APTw信号强度≤1.57%且无钆剂增强FLAIR高信号区被定义为瘤周组织。术中使用神经导航系统分别从每位受试者肿瘤实质区和瘤周水肿区取组织一对。3.影像分析方法(1)瘤内出血：在病灶内观察到局灶性T2w低信号或Tlw高信号认为是出现瘤内出血灶,必要时以SWI图印证。根据病灶是否合并瘤内出血将患者分为两组影像表型。(2) APTw/FLAIR和APTw/Gd-T1w:根据本论文第一部分内容的结果,以相对APTw信号强度(病灶APTw强度减去对侧CNAWM的APTw信号强度)大于1.57%定义为APTw高信号。运用IDL结合Mo计算病灶内APTw高信号面积。在APTw扫描对应层面的FLAIR及Gd-T1w图像上手工勾画出异常信号区域ROI,得出FLAIR及Gd-T1W高信号面积。将上述同一病灶层面的三个不同面积分别取比值得到APTw/FLAIR(AFR)和APTw/Gd-T1w(ATR),分别以0.8和1.0为分界值将16例患者分成对应的两对影像表型。4. mRNA提取及建库测序样品提取总RNA后,富集mRNA,反转录合成cDNA,纯化、脱洗后修饰末端、加碱基腺嘌呤、加测序接头引物,回收目的片段,经PCR扩增制备整个文库。]llumina HiSeq2000进行测序,产生的原始图像数据转化为序列数据,得到clean reads,用唯一比对上基因的reads数目和比对上参考序列的总reads数来计算基因表达量。基因表达量的计算使用RPKM法。查找出差异表达基因(Differential expression gene, DEG)的GO功能注释并采用GO功能显著性富集分析。5.筛选差异基因参照经典差异基因检测方法,多重假设检验校正p-value,控制假阳性率(False Discovery Rate, FDR)来决定p-value的域值。此外还将根据基因的表达量计算不同样本间的差异表达倍数。本研究设置FDR0.001同时倍数差异不低于2倍的基因为DEG。结果：1.合并出血的多形性胶质母细胞瘤NFS1表达显著下调(校正p值为5.87E-09)。2. BRCA1在APTw/FLAIR高值组较低值组显著下调(校正p值为0.000953)。3. SLAMF9和MIA在APTw/Gd-T1w高值组较低值组显著下调(校正 p值分别为1.08E-11和0.00997)。4.各表型的DEG显著富集GO-term详见表4-1。结论：本实验的初步结果显示了胶质母细胞瘤分子影像与基因特征的全新的联系,探讨了以蛋白质信号为基础的APTw影像学特征对应的潜在的基因改变,这在将来可能无创地提供胶质瘤母细胞瘤活体基因表达谱,为帮助患者有针对性地选择合适的精准治疗方案提供基因组学信息。
【关键词】：酰胺质子转移 淋巴瘤 胶质瘤 活检 组织病理 基因
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41;R445.2
【目录】：

• 摘要3-15
• ABSTRACT15-30
• 前言30-37
• 第一部分 应用酰胺质子成像鉴别原发性中枢神经系统淋巴瘤和高级别胶质瘤37-55
• 引言37-39
• 材料和方法39-43
• 结果43-52
• 讨论52-55
• 第二部分 APTw图像引导立体定向活检与组织病理学分析评估APTw信号作为新诊断胶质瘤的影像学生物标记物55-77
• 引言55-56
• 材料与方法56-65
• 结果65-74
• 讨论74-76
• 结论76-77
• 第三部分 酰胺质子转移成像鉴别恶性胶质瘤肿瘤复发和放射性坏死的临床价值77-98
• 引言77-79
• 材料和方法79-82
• 结果82-95
• 讨论95-97
• 结论97-98
• 第四部分 多形性胶质母细胞的影像基因组学初探：酰胺质子转移成像和信使RNA表达量98-110
• 引言98-99
• 材料与方法99-103
• 结果103-106
• 讨论106-110
• 不足与展望110-112
• .参考文献112-122
• 附录：中英文缩略词对照表122-123
• 博士研究生期间发表论文123-128
• 致谢128-130

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