铃蟾肽标记的氧化钆纳米微粒的制备及其靶向成像实验研究

发布时间：2017-09-09 23:26

  本文关键词：铃蟾肽标记的氧化钆纳米微粒的制备及其靶向成像实验研究

  更多相关文章： 氧化钆 胃泌素释放肽受体 铃蟾肽 分子影列腺癌靶向像学 磁共振 前列腺癌

【摘要】：背景：前列腺癌是严重威胁人类健康的一种恶性肿瘤,在欧美男性中高发,据美国癌症协会统计,2014年,男性肿瘤患者中,前列腺癌发病率居第一,为27%。前列腺癌早期症状不明显或者没有特异性,早期诊断困难,而早期诊断对治疗效果和预后有着重要意义,目前主要通过直肠指诊、前列腺特异性抗原生化指标,影像学检查方法如超声,CT和磁共振来做出诊断,目前的检查方法对于早期诊断的敏感性和特异性不足,确诊时多已为晚期。早期诊断对成像技术和方法提出了更高的要求。近年来,分子影像学和纳米技术的进步使得多模态的纳米材料有了较快的发展,可用于肿瘤的发现、诊断和治疗。特异性分子靶点的发现、高亲和力分子探针的设计及合成是推动分子影像学发展的动力。另外,由于肿瘤组织血管结构不同而引起的增强的通透性及滞留效应(EPR),有利于纳米材料在肿瘤组织的富集。理想的分子探针为特异性强、成像质量好,对比度高,生物安全性好的纳米材料。胃泌素释放肽受体(Gastrin releasing peptide receptor, GRPr)是一种G蛋白偶联受体,在前列腺癌细胞,乳腺癌细胞等许多肿瘤细胞表面高表达。GRPr在前列腺癌细胞表面高表达,而正常前列腺细胞和良性前列腺增生组织则不表达GRPr。铃蟾肽(bombesin,BBN),是一个含有14个氨基酸残基的多肽,由于其与27肽的胃泌素释放肽的有着相似的结构,因此对于GRPr有着很高的亲和力和特异性。可以用作分子影像学的一个靶点。目前BBN及其类似物已经开始用于GRPr阳性的肿瘤的研究。氧化钆纳米颗粒,在生物医学领域已有应用,由于其实是顺磁性物质,可以是缩短T1弛豫时间,可作为MR阳性对比剂,在增强对比度的同时还可以与多种配体连接,可用于多模态活体成像。在本研究中,我们尝试合成以GRPr为靶点,铃蟾肽BBN修饰、带荧光标记的顺磁性双模态纳米微粒Gd2O3-FI-PEG-BBN,并且对所制备的Gd2O3-FI-PEG-BBN纳米微粒的理化特性、细胞毒性、体外主动靶向PC-3细胞以及体内MR成像的效果等进行了初步评价,通过表面修饰使纳米微粒能同时发挥顺磁性及荧光对比剂的作用,可实现光学-MR双模态成像的对比增强,有利于早期诊断前列腺肿瘤及其转移灶,也为实时监测药物疗效与体内分布情况等探索新的途径。目的：1.制备铃蟾肽和荧光素双标记的氧化钆纳米微粒Gd2O3-FI-PEG-BBN,来作为一种靶向的MRI对比剂,并对其理化性质进行测定和评价。2.培养胃泌素释放肽受体(GRPr)阳性的人前列腺癌细胞系PC-3,评价Gd2O3-FI-PEG-BBN纳米微粒的细胞毒性和体外靶向前列腺癌细胞的有效性。3.制备前列腺癌荷瘤裸鼠模型,探讨Gd2O3-FI-PEG-BBN纳米微粒活体肿瘤靶向成像的可能性和体内成像的特点材料和方法：1.合成和评价1.1合成1.1.1 Gd2O3纳米微粒的制备：取Gd(OAC)3 (670 mg,2 mmol)溶解在30 mLDMSO中,搅拌均匀后缓慢滴加四甲基氢氧化铵(TMAH,200 mg,5.6mmol)和10 mL无水乙醇混合物。溶液室温下搅拌2h后离心分离,固体用乙醇洗涤三次得到Gd2O3。1.1.2 Gd2O3-FI的制备：取Gd2O3 (400mg)分散在DMSO中,加入5(6)-羧基荧光素(100mg),室温下搅拌12h后离心分离,固体分别用DMSO,乙醇和二氯甲烷洗涤三次得到荧光素表面修饰的Gd203。1.1.3 Gd2O3-FI-PEG的制备：取Gd2O3-FI (200mg)分散在DMSO中,加入a-羧基,w-羟基聚乙二醇(分子量2000)(100mg),室温下搅拌12h后离心分离,固体分别用DMSO,乙醇和二氯甲烷洗涤三次得到PEG和荧光素表面修饰的Gd2O3。1.1.4Gd2O3-FI-PEG-BBN的制备：采用传统的FMOC固相合成方法合成的铃蟾肽BBN(7-14),取Gd2O3-FI-PEG(100mg)分散在DMSO中,加入BBN (20mg), EDC.HCl (20mg)和4-二甲氨基吡啶DMAP (10mg),室温下搅拌12h后离心分离,固体分别用DMSO,乙醇和二氯甲烷洗涤三次得到携BBN、PEG和荧光素表面修饰的Gd2O3。1.2评价和表征1.2.1采用TEM观察Gd2O3-FI-PEG-BBN纳米微粒形态、大小Gd2O3-FI-PEG-BBN纳米微粒用去离子水稀释后,滴于敷有双面支撑膜的铜网上,静置约5分钟后,用滤纸小片从铜网边缘吸干多余液体,静置干燥后,置透射电子显微镜下观察纳米微粒子的大小和形态。1.2.2采用Malvern-3000HS激光粒度分析仪进行纳米微粒粒径及分布的测定用Malvem Zetasizer 3000HS激光散射粒度分析测定Gd2O3-FI-PEG-BBN纳米微粒的粒径及分布,取5u1,用蒸馏水稀释至测量杯中,放入样品槽中测试。1.2.3傅里叶变换红外光谱分析仪(FTIR)分析Gd2O3 and Gd2O3-FI-PEG-BBN纳米微粒的红外光谱将Gd203纳米微粒、Gd2O3-FI-PEG-BBN纳米微粒悬液滴在硒化锌窗片上,吹干,用FTIR仪扫描,扫描范围为4000-400 cm-1。1.2.4通过热重力分析(TGA)来测定Gd2O3-FI-PEG-BBN的成分取3.0mg Gd2O3-FI-PEG-BBN样品,使用Netzsch TG 209F1 Iris热重分析仪,温度在氮气流速率为100mL/min的条件下,以10℃/min的速率升至710℃。1.2.5不同浓度Gd2O3-FI-PEG-BBN纳米微粒MR成像。将Gd2O3-FI-PEG-BBN纳米微粒,溶解于去离子水中,配成含Gd浓度分别为0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0mmol/L有浓度梯度的溶液,分装在7个EP管中,每管4m1,采用philips 3.0T磁共振,8通道头线圈进行扫描,扫描参数为：TR：100,200,400,600,800,1000ms, TE:10ms,层厚：4mm,层间距：0.5mm, FOV:120×100×60mm,NSA:2,2. Gd2O3-FI-PEG-BBN肿瘤靶向体外实验研究选用的GRPr表达阳性的人前列腺癌细胞株PC-3来自美国ATCC,用含10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素双抗的的DMEM高糖培养液,放入5%CO2、37℃培养箱中静置培养。选择对数期生长细胞备用。2.1 Gd2O3-FI-PEG-BBN体外细胞毒性实验通过MTT法和PC-3细胞来检测Gd2O3-FI-PEG和Gd2O3-FI-PEG-BBN纳米微粒的毒性。接种3000个PC-3细胞／孔于96孔细胞培养板上,培养过夜。细胞已贴壁,吸去培养液,每孔加入经0.45um过滤器滤过除菌的Gd2O3-FI-PEG或Gd2O3--FI-PEG-BBN纳米微粒培养基悬液,设6个浓度梯度,分别为每孔含Gd0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mmol/L,每组设6个复孔,仅含培养基无细胞的6个孔作为调零孔,含等量细胞的不加药的完全培养基的6个孔作为对照组。分别培养24h和48h后,加MTT (5mg/mL)溶液20μL,继续培养4h后吸除培养液,每孔加入150μl DMSO,平板震荡仪震荡10min,在酶标仪(ELX80,BIOTEK, USA)中测定490nm波长处的吸光度值(OD值),按照此公式计算细胞存活率：细胞存活率(%)=(实验孔OD值-调零孔OD值)／(对照孔OD值-调零孔OD值)×100%。2.2体外靶向摄取实验2.2.1荧光显微镜观察靶向摄取实验将PC-3细胞的单细胞悬液,调整细胞密度,以4×105个/每孔接种于6孔细胞培养板上,在5%CO2、37℃培养箱中培养18h,吸去培养液,分为3组,每组2孔,实验组每孔加入溶有Gd2O3-FI-PEG-BBN纳米微粒(含Gd 0.8 mmol/L)的DMEM完全培养液2m1,对照组每孔加入溶有Gd2O3-FI-PEG纳米微粒(含Gd 0.8 mmol/L)的DMEM完全培养液2m1,空白对照组每孔加入DMEM完全培养液2m1,继续孵育4h后,吸去上清培养液,再用PBS液洗涤三遍,每孔加入4%多聚甲醛溶液0.5m1,固定15min后,用PBS液洗三遍,每孔加入DAPI染液100u1,室温下染3-5mmin后用PBS液洗三遍,每孔滴加约100u1的PBS液,倒置荧光显微镜下观察标记成功率。2.2.2流式细胞仪证实靶向摄取实验将PC-3细胞的单细胞悬液,调整细胞密度,以4×105个／每孔接种于6孔细胞培养板上,在5%C02、37℃培养箱中培养18h,吸去培养液,分为3组,每组2孔,实验组每孔加入溶有Gd2O3-FI-PEG-BBN纳米微粒(含Gd 0.8 mmol/L)的DMEM完全培养液2m1,对照组每孔加入溶有Gd2O3-FI-PEG纳米微粒(含Gd 0.8 mmol/L)的DMEM完全培养液2m1,空白对照组每孔加入DMEM完全培养液2m1,继续孵育4h后,吸去上层培养基,用PBS洗3遍,取出未结合的纳米微粒,加入胰酶消化,将细胞按分组收集,离心,细胞沉淀再用PBS洗2遍,离心,收集细胞沉淀,用500gL的PBS重悬,流式细胞仪检测分组检测荧光强度。2.2.3体外标记细胞的MR成像PC-3细胞均匀接种于6个直径为10cm的培养皿中,培养18h,分为三组,每组2皿,实验组每皿加入溶有Gd2O3-FI-PEG-BBN纳米微粒(含Gd 0.8mM)的DMEM完全培养液6m1,对照组每皿加入溶有Gd2O3-FI-PEG纳米微粒(含Gd 0.8mM)的DMEM完全培养液6m1,空白对照组每皿加入DMEM完全培养液6ml,37℃,5% CO2条件下孵育4h后用PBS冲洗3遍,胰酶消化1min,离心、收集细胞沉淀,细胞沉淀用PBS洗3遍,每皿细胞计数约3.0x106个,将洗净的细胞沉淀按分组分别置于3个1.5ml EP管内,重悬于500ul 1%的琼脂糖溶液中,以500u1的仅含1%的琼脂糖溶液的EP管做空白对照,将4支EP管编号并置于试管架上,放在装有去离子水的水槽中,采用临床用Philips Achieva 3.0T进行磁共振成像,选择8通道头部线圈,TSE序列的T1WI。扫描参数：翻转角90°,TR:500ms, TE:10ms,层厚：4mm,层间距：0mm, FOV:100×60×20mm,NSA：2。测量每组信号强度和噪声,采用SPSS16.0统计软件,靶向组、非靶向组和空白对照组之间的信噪比比较应用单向方差分析,两两比较采用SNK法,P0.05认为差异有统计学意义。3. Gd2O3-FI-PEG-BBN肿瘤靶向体内成像研究3.1建立前列腺癌荷瘤裸鼠模型在无菌条件下,将含有6×106个PC-3细胞的150gL细胞悬液注射入裸鼠的右侧肩背部皮下,约30天后,肿瘤直径达到1.0-2.0cm,随机分为实验组(靶向组)和对照组(非靶向组),备用。3.2肿瘤靶向MRI成像对两组荷瘤裸鼠经尾静脉分别注射Gd2O3-FI-PEG-BBN或者Gd2O3-FI-PEG(含Gd 4mmol/L,注射500uL),每只荷瘤裸鼠在注射前、注射后0.5h、1 h、2h、4h、8h和24 h行MR扫描,观察其对肿瘤T1WI信号的影响,探讨其用于体内肿瘤MR成像的可行性。采用临床用3.0T磁共振,选择小鼠线圈,TSE序列的T1WI,俯卧位采集冠状位图像,扫描参数为：TR:500ms, TE:10 ms, FOV:100×100×17mm,层数：8,层厚：2 mm,层间距：0mm, NSA:3。将采集到的原始数据导入Image J软件进行伪彩处理,将采集到的原始数据,通过phlips后处理工作站进行分析处理,选择肿瘤显示最清楚的层面,以肿瘤中心实行部分作为ROI,测量肿瘤区域平扫和增强后不同时间段的信号强度,计算出不同时间点的增强率。两组比较采用两独立样本T检验,P0.05认为有统计学意义。3.3肿瘤组织的荧光免疫病理学检测MR扫描结束后立即颈椎脱白法处死裸鼠,快速取其肿瘤组织,避光制作冰冻切片来观察肿瘤组织的荧光。结果：1制备和评价1.1 TEM观察Gd2O3-FI-PEG-BBN纳米微粒形态、大小Gd2O3-FI-PEG-BBN在透射电子显微镜下粒子呈球形,大小均匀,仅有少量聚集现象,分布较均匀,电子显微镜下估算其平均粒径大小约50-60nm。1.2Malvern-3000HS激光粒度分析仪进行纳米微粒粒径及分布的测定Gd2O3-FI-PEG-BBN纳米微粒通过Malvern-3000HS激光粒度分析仪来测定,Gd2O3-FI-PEG-BBN纳米微粒粒径分布集中,峰数为1,平均粒径约为90nm。1.3傅里叶变换红外光谱分析红外光谱分析,可以得到纳米粒子的化学结构信息,Gd203最显著的峰出现在1400-1600 cm-1范围内,主要是由反对称的及对称的COO-产生,属于羧酸盐伸缩模式,还有在3427 cm-1附近、1110cm-1附近出现强而宽的羟基键(-OH)和伸缩振动的C-O吸收峰,在2922 cm-1处出现弱的烷基键(C-H)吸收峰,在1600 cm-1附近出现羰基(C=0)吸收峰,BBN和PEG连接到Gd203表面之后,增加了甲硫氨酸的巯基,巯基的伸缩振动在2550-2590cm-1,但是一般较弱难以识别。1.4 Gd2O3-FI-PEG-BBN的热重力分析当加热到700℃时,Gd2O3-FI-PEG-BBN纳米颗粒总失重51%,400℃-700℃区间曲线趋于平坦。1.5 Gd2O3-FI-PEG-BBN纳米微粒MR成像随着Gd浓度的逐渐升高,Tl信号明显增强,在浓度为1mmol/L的时候已经有很明显的T1信号增强效果。2.Gd2O3-FI-PEG-BBN肿瘤靶向体外细胞实验研究2.1体外细胞毒性实验在Gd浓度为0-8mmol/L的范围内,Gd2O3-FI-PEG-BBN和Gd2O3-FI-PEG纳米颗粒引起PC-3细胞生存率下降趋势不明显,共孵育24h或48h,PC-3细胞短期生存率均大于80%,表示所合成的纳米微粒具有良好的生物安全性。2.2体外靶向摄取实验2.2.1荧光显微镜观察靶向摄取实验加入Gd2O3-FI-PEG-BBN的实验组,PC-3细胞形态正常,与空白对照组无区别。PC-3细胞核被染成明亮的蓝色,胞质充满绿色荧光,为内吞的Gd2O3-FI-PEG-BBN纳米微粒。而加入Gd2O3-FI-PEG的对照组以及未加药空白组,细胞核被染成亮蓝色,但是胞质内无绿色荧光或仅有本底的绿色荧光。2.2.2流式细胞仪证实靶向摄取实验以细胞荧光强度来表示纳米粒子的标记成功率,空白组FI荧光强度为296,实验组FI荧光强度为15326,而对照组为2067。流式细胞仪的结果也进一步验证了荧光显微镜观察的结果,靶向组Gd2O3-FI-PEG-BBN通过GRPr受体介导的内吞被PC-3细胞摄取,而非靶向组Gd2O3-FI-PEG仅有少量非特异性摄取。2.2.3标记细胞的MR成像Gd2O3-FI-PEG-BBN纳米微粒共孵育的实验组信噪比(SNR)明显高于与Gd2O3-FI-PEG纳米微粒共孵育的对照组、空白细胞对照组及琼脂糖对照组,差异均有统计学意义(P0.05),而Gd2O3-FI-PEG纳米微粒共孵育的对照组与空白细胞对照组的SNR无统计学意义((P0.05)),Gd2O3-FI-PEG-BBN向能通过受体选择性的能被细胞摄取,摄取的Gd2O3-FI-PEG-BBN可以引起MR T1 WI信号增强。3.Gd2O3-FI-PEG-BBN肿瘤靶向体内成像研究3.1建立前列腺癌荷瘤裸鼠模型成功建立了前列腺癌荷瘤裸鼠模型,动物状态良好,由于肿瘤细胞生长旺盛,体重偏轻,肿瘤直径约为1.0-2.0cm,表面无溃烂,成瘤率100%。随机分为2组,每组5只。3.2肿瘤靶向MRI成像荷瘤裸鼠尾静脉注射Gd2O3-FI-PEG-BBN或者Gd2O3-FI-PEG之后,肿瘤信号逐渐增强并于2h左右达到峰值,对比注射前和注射后2h肿瘤信号,注射Gd2O3-FI-PEG-BBN的靶向组,肿瘤区域在注射后T1WI信号强度2h信号明显增高,而注射Gd2O3-FI-PEG的对照组,信号增高不明显。靶向组强化率为27.95±5.86%,而对照组的强化率为4.02±2.24%,采用两独立样本T检验,差异有统计学意义(P0.05)。3.3肿瘤组织的荧光免疫病理学检测冰冻切片荧光显微镜下可见肿瘤区域细胞核蓝染,周围可见丰富的绿色焚光围绕,而非靶向对照组仅有少量绿色荧光,证明通过BBN与GRPr受体的结合,绿色荧光素FI标记的Gd2O3-FI-PEG-BBN可被肿瘤细胞选择性摄取,并能有效地在肿瘤组织中富集。结论：本研究成功制备了铃蟾肽BBN和荧光素Fl双标记的氧化钆纳米颗粒Gd2O3-FI-PEG-BBN分子探针,有较好的水溶性、生物相容性、荧光显像及MRIT1增强效果好,能选择性地在前列腺癌肿瘤组织富集,能有效进行荧光显像和MR成像,可用于光学-MR双模态前列腺癌靶向成像。
【关键词】：氧化钆 胃泌素释放肽受体 铃蟾肽 分子影列腺癌靶向像学 磁共振 前列腺癌
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.25;R445.2
【目录】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-25
• 前言25-29
• 第一章 Gd_2O_3-FI-PEG-BBN制备与评价29-38
• 1.1 材料与方法29-31
• 1.1.1主要试剂29
• 1.1.2 主要仪器29
• 1.1.3 方法29-31
• 1.2 结果31-34
• 1.2.1 制备31
• 1.2.2 TEM观察Gd_2O_3-FI-PEG-BBN纳米微粒形态、大小31-32
• 1.2.3 Malvern-3000HS激光粒度分析仪进行纳米微粒粒径及分布的测定32
• 1.2.4 傅里叶变换红外光谱分析32-33
• 1.2.5 热重力分析TGA33-34
• 1.2.6 Gd_2O_3-FI-PEG-BBN纳米微粒MR成像34
• 1.3 讨论34-37
• 1.4 结论37-38
• 第二章 Gd_2O_3-FI-PEG-BBN肿瘤靶向体外实验研究38-50
• 2.1 材料和方法38-41
• 2.1.1 所用细胞及试剂38
• 2.1.2 仪器及耗材38-39
• 2.1.3 细胞培养39
• 2.1.4 体外细胞毒性实验39-40
• 2.1.5 体外靶向摄取实验40-41
• 2.2 结果41-45
• 2.2.1 体外细胞毒性实验41-42
• 2.2.2 体外靶向摄取实验42-45
• 2.3 讨论45-49
• 2.4 结论49-50
• 第三章 Gd_2O_3-FI-PEG-BBN肿瘤靶向体内成像研究50-58
• 3.1 材料和方法50-52
• 3.1.1 实验材料和仪器50
• 3.1.2 方法50-52
• 3.2 结果52-55
• 3.2.1 建立前列腺癌荷瘤裸鼠模型52
• 3.2.2 荷瘤裸鼠MRI成像52-54
• 3.2.3 肿瘤组织的荧光免疫病理学检测54-55
• 3.3 讨论55-57
• 3.4 结论57-58
• 参考文献58-63
• 中英文缩略词对照63-65
• 攻读硕士学位期间的成果65-66
• 致谢66-67

【共引文献】

中国博士学位论文全文数据库 前2条

1 程华;岩黄连细胞培养合成生物碱研究[D];华中科技大学;2006年

2 高识;~(99m)Tc-RGD-BN在乳腺肿瘤中的诊断价值研究[D];吉林大学;2014年

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本文编号：823384