CRABP2基因过表达逆转卵巢癌铂类耐药对肿瘤微环境影响探究及卵巢癌3D共培养初探

发布时间：2017-10-11 09:14

  本文关键词：CRABP2基因过表达逆转卵巢癌铂类耐药对肿瘤微环境影响探究及卵巢癌3D共培养初探

  更多相关文章： 卵巢上皮癌 铂类耐药 CRABP2 微环境 细胞因子 三维共培养

【摘要】：目的 本课题组在前期已经成功建立了卵巢癌的裸鼠顺铂耐药模型,得到顺铂获得性耐药卵巢癌细胞株SKOV3-GFP/DDPⅡ,然后成功构建了CRABP2基因过表达的顺铂耐药卵巢癌细胞SKOV3-GFP/DDPⅡ-CRABP2,并且采用]mcherry红色荧光标记。检测CRABP2基因过表达后对卵巢癌微环境中细胞因子的影响以及CRABP2基因过表达逆转卵巢癌细胞铂类耐药在动物模型中的表达验证,探讨CRABP2基因过表达后对细胞凋亡与细胞周期信号通路的影响。另外,建立SKOV3/DDPⅢ与间皮细胞,成纤维细胞三维共培养模型更好地模拟卵巢癌细胞的生长微环境,对三维共培养方法进行初探。为寻找逆转卵巢癌顺铂耐药的新的靶点奠定基础。方法利用课题组前期已经成功建立的顺铂获得性卵巢癌耐药细胞株SKOV3-GFP/DDPⅡ和亲本顺铂敏感细胞株SKOV3-GFP,分别种植在裸鼠皮下待其成瘤后分次顺铂体内干预,实时荧光定量PCR检测细胞因子的动态表达变化。利用CRABP2基因过表达的顺铂耐药卵巢癌细胞株SKOV3-GFP/DDPⅡ-CRABP2和空载对照组细胞株SKOV3-GFP/DDPⅡ-mcherry,分别种植在裸鼠皮下待其成瘤后分次顺铂体内干预,Western Blot检测CRABP2基因过表达后对移植瘤下游Fas细胞凋亡信号通路上节点基因的蛋白表达和周期调控相关蛋白表达的影响。同时进行实时荧光定量PCR检测细胞因子的动态表达变化。采集人腹腔大网膜标本,分离纯化得到间皮细胞和成纤维细胞。利用Transwell小室,间皮细胞,成纤维细胞,SKOV3/DDPⅢ搭建三维共培养模型,底层为成纤维细胞,中层为间皮细胞,上层为SKOV3/DDPⅢ利用Clarity法包埋成去脂透明的高通透性立体模型,利用免疫荧光法观察三维共培养模型并进行三维成像。结果QRT-PCR的结果表明：注射顺铂药物后,敏感组表达高于耐药组的细胞因子有22个：敏感组表达低于耐药组的细胞因子有5个。在过表达CRABP2基因和其空载对照组中,注射顺铂药物后,空载对照组表达低于过表达CRABP2组的细胞因子有20个；空载对照组表达高于过表达CRABP2组的细胞因子有7个。注射顺铂药物后,空载对照组表达高于过表达CRABP2组中有4个细胞因子与注射顺铂药物后的敏感组表达低于耐药组的细胞因子相同,过表达CRABP2组表达高于空载对照组中有19个细胞因子与敏感组表达高于耐药组的细胞因子相同。因此,过表达CRABP2基因通过影响肿瘤的微环境来逆转卵巢癌的铂类耐药。相对于SKOV3-GFP/DDPII和空载对照组的SKOV3-GFP/DDPII-mcherry细胞株的裸鼠皮下移植瘤而言,过表达CRABP2的SKOV3-GFP/ DDPII-CRABP2细胞株的裸鼠皮下移植瘤的细胞周期被抑制,细胞凋亡途径被激活：随顺铂注射次数的增加,Fas信号转导通路上的Fas, FADD, Caspase9和Caspase3在过表达CRABP2移植瘤组织中的蛋白质表达相对于耐药移植瘤组织和它的空载对照移植瘤组织呈现出上调趋势(P0.05),而PARP1则在过表达CRABP2移植瘤组织中蛋白质表达相对于耐药组织和它的空载对照移植瘤组织呈现出下调趋势(P0.05)；随着顺铂次数的增加,细胞周期的依赖性蛋白激酶CDK6, CDK4和细胞周期蛋白cyclinDl在过表达CRABP2移植瘤组织中的蛋白质表达相对于耐药移植瘤组织和它的空载对照移植瘤组织呈现出下调趋势(P0.05),而细胞周期阻断剂p27 kip1则在过表达CRABP2移植瘤组织中蛋白质表达相对于耐药组织和它的空载对照移植瘤组织呈现出上调趋势(P0.05)。即过表达CRABP2基因后的卵巢癌顺铂耐药细胞恢复了对顺铂的敏感性。三位共培养模型免疫荧光观察上层为SKOV3/DDPIII,中间为间皮细胞,下层为混有成纤维细胞的基质胶。结论过表达CRABP2后可使耐药的卵巢癌细胞恢复对顺铂的敏感性,影响肿瘤的微环境抑制细胞周期中的G1/S期、激活Fas凋亡信号通路的作用来逆转卵巢癌耐药。这给临床上逆转卵巢癌铂类耐药的治疗提供了新的靶点和理论基础。并且利用三维共培养模型可以更好地模拟卵巢癌细胞的生长微环境来研究肿瘤微环境对铂类耐药的影响。
【关键词】：卵巢上皮癌 铂类耐药 CRABP2 微环境 细胞因子 三维共培养
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.31
【目录】：

• 个人简历3-6
• 主要中英文缩略语对照6-10
• 中文摘要10-13
• 英文摘要13-17
• 第一章 肿瘤微环境在卵巢癌复发耐药机制中的作用(文献综述)17-34
• 1 肿瘤微环境17-18
• 2. 基质细胞与卵巢癌复发耐药18-22
• 3. 细胞因子与卵巢癌复发耐药22-28
• 4. 免疫细胞与卵巢癌复发耐药28-29
• 5. 肿瘤干细胞与卵巢癌复发耐药29-30
• 6 脉管系统与卵巢癌复发耐药30-31
• 7. 肿瘤酸性环境、低氧环境介导的卵巢癌复发耐药31
• 8. 癌细胞在微环境中耐药性形成的分子机制和对微环境的影响31-32
• 9. 结语32-34
• 第二章 铂类耐药动物模型中肿瘤微环境细胞因子的动态变化34-56
• 前言34
• 1 实验材料34-37
• 2 实验方法37-44
• 3 结果44-51
• 4 讨论51-56
• 第三章 过表达CRABP2基因逆转卵巢癌细胞铂类耐药在动物模型中的表达验证56-76
• 前言56-57
• 1 实验材料57-61
• 2 实验方法61-67
• 3 结果67-72
• 4 讨论72-76
• 第四章 CRABP2调控肿瘤微环境细胞因子逆转铂类耐药的机制76-86
• 前言76
• 1 实验材料76
• 2 实验方法76-78
• 3 结果78-85
• 4 讨论85-86
• 第五章 三维共培养模型模拟肿瘤微环境方法初探86-96
• 前言86
• 1 实验材料86-87
• 2 实验方法87-91
• 3 结果91-94
• 4 讨论94-96
• 第五章 全文总结96-97
• 参考文献97-113
• 附录113-122
• 致谢122

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本文编号：1011686