WTH3表达对人卵巢癌细胞耐药性影响的研究

发布时间：2017-10-20 05:34

  本文关键词：WTH3表达对人卵巢癌细胞耐药性影响的研究

  更多相关文章： DNA甲基化 WTH3 MDR 人卵巢癌细胞株

【摘要】：研究背景 化疗作为一种重要的治疗手段广泛的应用在肿瘤的治疗中，但肿瘤耐药性的发生成为化疗失败的主要原因。它的发生发展是众多因素共同作用参与的结果，在肿瘤耐药的发生机制中，表观遗传学调控具有重要作用，DNA甲基化为表观遗传学的一种，在近几十年间，人们对DNA甲基化与肿瘤发生发展关系的研究越来越广泛与深入，探寻并获得这些细胞事件与生物学机制中我们所未知的信息有助于我们解决肿瘤治疗中的难题，并为肿瘤的临床治疗提供了一个新思路。 研究表明，DNA甲基化在很大程度上影响着肿瘤和肿瘤耐药的发生，肿瘤的发生过程中常伴有DNA的甲基化异常，最常见的就是基因序列局部区域的高甲基化，高甲基化异常主要发生在人类基因组中的CpG岛上， CpG主要存在于基因的5'区，具有调节基因转录与表达的重要作用，当基因甲基化状态发生改变时则会导致基因转录和表达异常，从而引发机体产生疾病。 WTH3是人们在用甲基化敏感性代表性差异分析法研究MDR时发现的一个可能的抗耐药基因，在人类乳腺癌耐药细胞株（MCF7/AdrR）中WTH3启动子区高甲基化，WTH3不表达，而在人类乳腺癌非耐药细胞株（MCF7/WT）中则相反。对其的进一步研究发现，WTH3参与多种耐药细胞系耐药性的发生。对MES-SA/Dx5（一种子宫肉瘤）、MCF7/AdrR和早期耐药乳腺癌上皮细胞系进行研究发现WTH3在以上细胞中都低表达，且其启动子区发生了超甲基化，之后将WTH3重新导入以上细胞系中发现耐药基因MDR1的表达下降，并增加了以上肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性，当在人胚肾上皮细胞293（human embryonickidney293，HEK293）中沉默了WTH3的表达后发现多药耐药基因（MDR1）的表达上调，这表明耐药基因MDR1的表达与WTH3的表达负相关，WTH3可以作为一种抗耐药基因参与肿瘤耐药的发生过程。 本文主要研究WTH3在人卵巢癌细胞株SKOV3，人卵巢癌耐顺铂细胞株SKOV3/DDP中的表达情况，通过亚硫酸氢盐直接克隆测序法检测两种细胞系中WTH3启动子区的甲基化水平，之后通过重组质粒构建转导方法探究WTH3的表达对肿瘤耐药性的影响。为今后我们肿瘤的耐药性研究打下坚实的基础。 方法 本实验选取SKOV3和SKOV3/DDP作为研究对象，采用RT-PCR技术检测两种细胞系中WTH3mRNA表达情况；采用亚硫酸盐直接克隆测序法检测在两种细胞系中基因组启动子区的甲基化水平，，构建重组质粒pIRES2 EGFP-WTH3，将WTH3转导到SKOV3/DDP细胞中以研究WTH3的表达对肿瘤细胞耐药性的影响。 结果 RT-PCR结果显示，WTH3mRNA在SKOV3中高表达，在SKOV3/DDP中不表达。亚硫酸氢盐直接克隆测序法结果显示，SKOV3和SKOV3/DDP两种细胞系中WTH3启动子区的甲基化水平分别为0-13％，78％-91.3％，有显著差异。重组质粒转导入SKOV3/DDP细胞中后，抗肿瘤药物顺铂对其抑制作用明显增加。 结论 1.WTH3在非耐药的SKOV3细胞中表达阳性，在耐药的SKOV3/DDP中表达阴性，推测WTH3的表达与细胞耐药具有相关性。 2.WTH3启动子甲基化水平在SKOV3和SKOV3/DDP中有着显著差别，在SKOV3/DDP细胞系中其启动子区发生了甲基化改变，推测其启动子区甲基化水平对WTH3的表达密切相关。 3.导入重组质粒pIRES2 EGFP-WTH3的SKOV3/DDP对抗肿瘤药物的敏感性明显增加，耐药性降低，表明WTH3的表达可改变肿瘤细胞对抗肿瘤药物的耐药性，并可作为调控多药耐药（MDR）的一个新的治疗靶点。
【关键词】：DNA甲基化 WTH3 MDR 人卵巢癌细胞株
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.31
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 英文缩写词表12-13
• 第1章 绪论13-20
• 1.1 DNA 甲基化13-15
• 1.1.1 DNA 甲基化与表观遗传学13
• 1.1.2 DNA 甲基化与 CpG 岛13-14
• 1.1.3 DNA 甲基化与肿瘤14-15
• 1.1.4 DNA 甲基化的检测方法15
• 1.2 肿瘤耐药15-17
• 1.2.1 肿瘤耐药的分类15-16
• 1.2.2 MDR 的耐药机制16-17
• 1.3 WTH317-20
• 1.3.1 WTH3 的分子结构和细胞分布17
• 1.3.2 WTH3 与 MDR 的关系17-18
• 1.3.3 WTH3 的表达调控机制18-20
• 第2章 材料与方法20-39
• 2.1 实验材料20-24
• 2.1.1 细胞系20
• 2.1.2 主要仪器及设备20-21
• 2.1.3 主要试剂21
• 2.1.4 主要试剂配制21-24
• 2.2 实验方法24-39
• 2.2.0 SKOV3,SKOV3/DDP 细胞复苏、培养、传代及冻存24
• 2.2.1 SKOV3,SKOV3/DDP 细胞生长情况测定24-25
• 2.2.2 SKOV3,SKOV3/DDP 细胞中 RNA 的提取25-26
• 2.2.3 RT-PCR 检测 WTH3 的表达26-28
• 2.2.4 SKOV3,SKOV3/DDP 细胞中 DNA 提取28-29
• 2.2.5 基因组 DNA 的甲基化修饰29-30
• 2.2.6 基因组 DNA 修饰后 PCR 扩增 WTH3 启动子区域30-31
• 2.2.7 PCR 产物目的片段回收31-32
• 2.2.8 目的 DNA 片段与 T 载体连接32-33
• 2.2.9 CaCl2 法感受态细胞制备33
• 2.2.10 细胞转化33-34
• 2.2.11 克隆细胞鉴定34-35
• 2.2.12 克隆细胞扩增、测序35
• 2.2.13 WTH3 表达质粒载体构建35-39
• 第3章 结果39-48
• 3.1 SKOV3,SKOV3/DDP 细胞的培养39-41
• 3.2 WTH3MRNA 在 SKOV3,SKOV3/DDP 细胞中的表达及启动子区的甲基化41-44
• 3.2.1 WTH3 在 SKOV3,SKOV3/DDP 细胞中的表达41
• 3.2.2 基因组 DNA 修饰后 PCR 扩增 WTH3 启动子区域41-42
• 3.2.3 PCR 鉴定连接情况42
• 3.2.4 WTH3 启动子区42
• 3.2.5 甲基化位点测序结果42-44
• 3.3 重组质粒 PIRES2 EGFP-WTH3 的构建和表达44-48
• 3.3.1 WTH3 目的基因片段44
• 3.3.2 重组质粒双酶切鉴定44-45
• 3.3.3 测序45
• 3.3.4 转染后 EGFP 表达的检测45-46
• 3.3.5 RT-PCR 检测转染后 SKOV3/DDP 细胞中 WTH3mRNA 的表达46
• 3.3.6 转染后细胞对肿瘤药物的敏感性46-48
• 第4章 讨论48-51
• 4.1 WTH3MRNA 在 SKOV3、SKOV3/DDP 中的表达48-49
• 4.2 WTH3 启动子区域甲基化水平的检测49-50
• 4.3 重组质粒 pIRES2 EGFP-WTH3 的构建和表达对 SKOV3/DDP耐药性影响的检测50-51
• 第5章 结论51-52
• 参考文献52-56
• 作者简介56-57
• 致谢57

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 文玉;李晓燕;;DNA甲基化与结直肠癌[J];医学综述;2011年17期

本文编号：1065520