随机噬菌体12肽库筛选宫颈癌患者血清肿瘤标志物的初步研究

发布时间：2017-10-25 06:31

  本文关键词：随机噬菌体12肽库筛选宫颈癌患者血清肿瘤标志物的初步研究

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【摘要】：背景宫颈癌在发展中国家上升为第2位女性常见的恶性肿瘤,仅次于乳腺癌。据世界卫生组织估计,在宫颈癌每年新发病例数中,中国约占世界总发病数的28%。已严重威胁中国女性健康,造成社会的重大负担。但宫颈癌早期发现后及时治疗效果显著、预后良好。有文献报道早期宫颈癌的5年生存率可达92%,因此宫颈癌的早发现、早期诊断和治疗是非常重要的。目前宫颈癌的诊断方法包括传统的宫颈涂片细胞学检查、阴道镜检查和组织学检查。一定程度上提高了宫颈癌在早期的诊断,但这些方法依然仍有各自的缺陷,如巴氏涂片检查灵敏度低,阴道镜检查难以检查到细小的病灶,组织活检的依从性差等。近年血清肿瘤标志物如糖链抗原199(CA199)、鳞状上皮细胞癌抗原(SCC-Ag)、血清糖类抗原125(CA125)、癌胚抗原(CEA)已作为宫颈癌的辅助检测项目,但其总的灵敏度和特异度并不高。所以寻找一种针对早期宫颈癌其灵敏度和特异度都高的血清肿瘤标志物非常重要。Smith发明的噬菌体展示技术(PDT)对寻找肿瘤血清标志物提供了条件,本研究利用PDT,以早期宫颈癌患者血清为靶分子,可能筛选出与宫颈癌患者血清特异性结合的短肽。目的用随机噬菌体12肽库对宫颈癌患者血清进行三轮差异性淘选,找出能与宫颈癌患者血清特异性结合的阳性噬菌体株,通过扩大样本和与不同种类的肿瘤患者血清进行再鉴定,挑出与早期宫颈癌患者血清特异结合且亲和力最高的噬菌体株,将其提取单链DNA后进行测序得到相应短肽,为宫颈癌的早期诊断提供新的肿瘤标志物,为进一步寻找宫颈癌相关肿瘤标志物奠定了基础。方法 1.采取6例正常人血清及6例早期宫颈癌患者新鲜血清分别混合包被在96孔酶标板中(两孔正常人血清,一孔宫颈癌患者血清),进行三轮差异性筛选,每轮都先将噬菌体肽库与前两孔正常人血清结合,再将剩余未结合噬菌体移至第三孔与早期宫颈癌患者血清结合,结合后用洗脱液洗脱第三孔与早期宫颈癌患者血清结合的噬菌体,并对其进行扩增,通过三轮的筛选与扩增,与早期宫颈癌患者血清亲和力高的噬菌体得到富集,得到特异性结合的阳性噬菌体。2.用最后一轮筛选所得的噬菌体划板培养。在每块板上选取多个相对距离较远的单克隆噬菌体株,对其扩增,然后用筛选时的6例正常人血清及6例早期宫颈癌患者血清用ELISA法检测所选取的各单克隆噬菌体株与早期宫颈癌患者血清的亲和力,选取出颜色稳定且差别明显的几株阳性噬菌体。3.再扩大样本含量检测所筛选出的噬菌体对早期宫颈癌患者血清的亲和力,挑选出与早期宫颈癌患者血清结合亲和力最好的噬菌体株。4.对挑选出的阳性噬菌体株提取其单链DNA进行测序,再根据遗传密码表得到相应的短肽。结果 通过三轮筛选,与宫颈癌患者血清结合的噬菌体富集率逐轮提高,提高近100倍。挑取单个噬菌体株后经反复ELISA验证后得到特异性较好的7号噬菌体株。7号噬菌体克隆行ELISA检测6例正常人血清及6例宫颈癌患者血清,结果显示正常人组OD值为0.056±0.010,宫颈癌组为0.151±0.040,P0.05,差异有统计学意义；7号噬菌体克隆行ELISA检测50例正常人血清及50例宫颈癌患者血清,结果显示正常人组OD值为0.070±0.023,宫颈癌组为0.157±0.040,P0.05,差异有统计学意义；ELISA验证7号噬菌体克隆分别与8例宫颈癌患者血清、8例CIN患者血清、8例卵巢癌患者血清及8例正常人血清行ELISA检测,结果显示宫颈癌患者组OD值为0.174±0.018,卵巢癌组为0.052±0.007,CIN组为0.076±0.010,正常人组为0.052±0.006,宫颈癌组与其他组差异有统计学意义。分析7号噬菌体ROC曲线下面积为0.956,P0.0001,有统计学意义,ROC曲线下面积95%的可信区间为[0.896,0.987]；Medcalc软件分析其特异度为94%及敏感性为84%;7号噬菌体测序结果为：5'-ATG CAC CGG ACG CGT CAG CGA ACC ATT CGT AGC CGA-3',氨基酸序列为：SATNGSLTRPVH。7号噬菌体克隆的DNA序列与鼠类、人类行同源核酸比对,未见其同源序列；将7号噬菌体克隆的氨基酸序列进行比对,未发现与该氨基酸同源的蛋白结构,与已知的蛋白多肽序列的相似性也不高。结论：可能淘选出与早期宫颈癌患者血清特异结合且高亲和力的短肽,为以后研究宫颈癌肿瘤标志物及宫颈癌的早期诊断、预后及复发监测奠定了基础,也有助于宫颈癌发生发展机制的研究。
【关键词】：噬菌体随机肽库 宫颈癌 肿瘤标志物
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.33
【目录】：

• 个人简历3-9
• 摘要9-12
• Abstract12-16
• 前言16-19
• 1 材料19
• 2 试剂19-22
• 3 主要设备22
• 4 实验步骤22-30
• 4.1 Ecoli ER2738大肠杆菌株的活化及培养22
• 4.2 对宫颈癌患者血清的减性筛选22-26
• 4.3 噬菌体滴度测定的方法26-27
• 4.4 噬菌斑的扩增27
• 4.5 用ELISA法检测所筛选噬菌体克隆与靶分子的结合27-29
• 4.6 提纯阳性噬菌体测序模板29-30
• 4.7 阳性噬菌体DNA的测序30
• 4.8 统计和生物信息学分析方法30
• 5 结果30-45
• 5.1 三轮递减筛选后阳性噬菌体的得率30-32
• 5.2 阳性噬菌体所表达多肽的ELISA检测32-37
• 5.3 绘制7号噬菌体克隆的ROC曲线及分析其曲线下面积37-39
• 5.4 测序39-45
• 6 讨论45-51
• 结论51-52
• 综述：宫颈癌肿瘤标志物诊断及预后研究进展52-60
• 1 人乳头瘤病毒52-53
• 2 肿瘤细胞增殖与凋亡标志物53-55
• 3 肿瘤相关性抗原55-56
• 4 MA15356-57
• 5 OPN57-58
• 6 DNA甲基化58
• 7 细胞角蛋白58-59
• 8 结语59-60
• 参考文献60-73
• 致谢73-74
• 攻读学位期间发表的论文74

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

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中国硕士学位论文全文数据库 前3条

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本文编号：1092496