骨髓间充质干细胞对POF大鼠卵巢修复作用研究

发布时间：2017-11-09 12:18

  本文关键词：骨髓间充质干细胞对POF大鼠卵巢修复作用研究

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【摘要】：目的探讨骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)在POF(Premature ovarian failure,POF)大鼠卵巢内的归巢及对卵巢功能调节作用,为BMSCs移植治疗卵巢早衰提供实验基础。方法1、大鼠BMSCs的体外分离、培养、鉴定及标记:通过差异贴壁法从SD大鼠骨髓中分离BMSCs,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养。采用流式细胞仪检测BMSCs表面因子CD29、CD45、CD34及CD90的表达鉴定BMSCs。流式细胞仪检测BMSCs细胞周期明确细胞的生长特性。用携带增强型绿色荧光蛋白基因的腺病毒(Ad-EGFP)转染BMSCs,分别用转染复数(Multiplicity of infection,MOI)为50、100、150、200、400的Ad-EGFP转染BMSCs,在24小时、48小时及72小时用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达及细胞形态变化,寻找最佳MOI。2、体外BMSCs对顺铂损伤颗粒细胞的影响:分离培养大鼠卵巢颗粒细胞(granulosa cells,GCs),通过免疫细胞化学检测促卵泡激素受体(follicle stimulating hormone receptor,FSHR)在颗粒细胞中表达来鉴定GCs。GCs加入不同浓度的顺铂(分别为1mg/L、2.5 mg/L、5 mg/L、7.5 mg/L、10 mg/L),通过CCK-8检测顺铂对GCs生长影响,选用最佳浓度。在最佳浓度的顺铂作用下将BMSCs和GCs以1:1比例共培养,48小时后收集GCs,Annexin-V/PI法检测GCs凋亡率,并用结晶紫染色,观察GCs形态变化。应用Transwell法检测BMSCs向顺铂损伤的GCs迁移能力。3、BMSCs在顺铂所致POF大鼠卵巢内归巢及对卵巢功能修复作用:SD大鼠连续腹腔注射顺铂(2mg/kg)6天建立POF动物模型。大鼠分为3组,每组10只:正常组,POF模型组,BMSCs治疗组。将用增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记的BMSCs经尾静脉移植到POF大鼠体内,在移植后第15天和30天分批处死大鼠,收集血液和卵巢等组织。通过化学发光法检测血清中雌激素水平;HE染色后观察大鼠卵巢结构及卵泡发育情况;免疫组织化学法检测BMSCs在大鼠卵巢内分布及定位;采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL法)检测卵巢GCs凋亡。结果1、原代BMSCs在接种24小时后贴壁生长,呈圆形,72小时后部分贴壁细胞形态为长梭形。第3代BMSCs表达CD29、CD90,而不表达CD34、CD45。BMSCs多数处于静止期及DNA合成前期,只有少数处于DNA合成期和有丝分裂期。当MOI为200时,EGFP标记率高,且对细胞形态及生长无明显影响,EGFP在转染24小时后开始表达,72小时后高表达。2、原代GCs在接种48小时后贴壁生长,呈圆形,细胞稀疏,传代后细胞呈集落样生长。第1代GCs表达FSHR,而多边形及梭形杂细胞表达阴性。当顺铂浓度为5mg/L和7.5mg/L时,颗粒细胞生长明显受抑制。BMSCs与GCs共培养后,GCs存活率升高,凋亡率降低。当GCs受顺铂损伤后,BMSCs向损伤的GCs迁移数明显多于向正常GCs迁移数。3、BMSCs移植后,BMSCs主要分布在大鼠卵巢门和卵巢髓质中,在卵巢皮质有少量的BMSCs,且部分BMSCs围绕在卵泡周边,而在卵泡和黄体中没有BMSCs的分布。BMSCs移植30天后,在BMSCs治疗组大鼠卵巢中,窦状卵泡和雌二醇水平明显高于POF模型组。在BMSCs治疗组大鼠卵巢中可见各级卵泡发育,并且有发育良好的窦状卵泡及黄体。结论1、分离培养的BMSCs形态均一,表型稳定,纯度高,可用于进一步的生物学研究。用Ad-EGFP转染BMSCs安全、高效,可用于BMSCs的标记及示踪。2、BMSCs对顺铂损伤的卵巢颗粒细胞有保护作用。3、BMSCs可迁移到POF大鼠卵巢并有效地改善卵泡发育。因此,BMSCs可能是治疗POF有效的手段之一。
【学位授予单位】：辽宁医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R711.75

【共引文献】

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本文编号：1161846