多靶点抗血管生成纳米药物应用于卵巢癌治疗的基础研究

发布时间：2017-11-18 11:23

  本文关键词：多靶点抗血管生成纳米药物应用于卵巢癌治疗的基础研究

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【摘要】：研究背景卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,是一种发病率高、死亡率高的妇科恶性肿瘤,近年来发病率呈逐年增加的趋势。《2012NCCN卵巢癌临床实践指南(第2版)》指出,卵巢癌首选的治疗方法是手术治疗,然后是化疗、生物学治疗、激素治疗、放疗等。目前治疗卵巢癌的化疗药物主要有紫杉醇、铂类、曲贝替定等。卵巢癌组织有血管丰富、生长迅速的特点,虽对化疗比较敏感,但由于化疗药物的毒副反应及长期治疗产生的耐药,使疗效大打折扣,其五年生存率仍然很低,徘徊在30-40%。因此目前迫切需要寻找治疗卵巢癌的新方法,以提高卵巢癌患者的五年生存率。卵巢癌的抗血管生成治疗是近些年来研究的热点,尤其是以肿瘤血管为靶向的治疗已成为肿瘤治疗的一个前沿性课题。肿瘤的生长和侵袭转移依赖于丰富的血供及血管形成,肿瘤的新生血管不仅向肿瘤组织输送营养物质和排泄代谢废物,而且是肿瘤细胞血行转移的主要环节之一。抑制肿瘤血管生成,能显著抑制肿瘤的生长和转移,这为卵巢癌治疗开辟了一条新的途径。卵巢癌是一种实体肿瘤,由两个相对独立的部分组成：肿瘤实质和肿瘤间质,在肿瘤间质中存在着高密度的微血管,卵巢癌的生长转移与这些微血管的形成密切相关。以肿瘤血管内皮细胞为研究对象,与直接针对肿瘤细胞的化疗相比具有低不良反应、低耐药性等优点。抗肿瘤血管生成已经成为继手术、化疗和放疗之后的“第四治疗模式”。而口前应用的大多数抗血管生成药物针对的靶点单一,由于血管生成在不同生长时期存在不同的血管微环境,使其不能至始至终发挥作用。如能找到对多种促血管生成因子均有作用的药物,或选择多种血管生成因子信号传导途径中的交叉点或多个靶点进行抑制,效果可能会更好。此外,同时针对肿瘤细胞和血管内皮细胞治疗可能产生更好的治疗效果,因此本课题提出开发针对多个肿瘤血管生成环节为靶点的、同时作用于肿瘤血管内皮细胞和肿瘤细胞的抗血管生成药物。目前抗血管生成药物的进药方式主要是静脉注射,然而由于抗血管生成药物大多是普通剂型,在血液中容易受到各种酶类的降解,使其到达有效部位药物浓度低,导致其出现生物利用率下降、治疗效果不理想等情况。以生物大分子为载体的自组装纳米药物具有良好的生物相容性,表面易于修饰等特点,特别是其在肿瘤组织具有高通透性和滞留性,能够延长药物在体内的循环时间,逃避网状巨噬细胞的吞噬,增加药物利用率。因此,开发多靶点抗血管生成纳米药物可能弥补这一方面的缺陷。而这种以生物大分子为载体的纳米药物可以利用其表面易于修饰等特点,通过物理或化学方法携带多种活性成分,应用这种策略于开发多靶点抗血管生成纳米药物,并应用于卵巢癌治疗。VEGF是特异性最强的促内皮细胞分裂的生长因子,能够与其受体VEGFR结合,促进血管内皮细胞的增殖,在肿瘤组织中参与肿瘤血管的生成。VEGF通过旁分泌机制促进血管生成通过自分泌机制促进肿瘤细胞增殖,来参与卵巢癌细胞的增殖浸润和转移,以VEGF或VEGFR为靶点的抗血管生成疗法成为可行的意义深远的治疗卵巢癌的新方法。整合素为细胞黏附分子家族的重要成员之一,主要介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质(ECM)之间的相互黏附,并介导细胞与ECM之间的双向信号传导。整合素在多种肿瘤表面和新生血管内皮细胞中有高表达,对肿瘤血管生成起着重要作用,其中αvβ3的作用尤为重要。整合素αvβ3通过抑制内皮细胞凋亡,在血管形成过程中起重要作用,因此,以αvβ3为靶点诱导内皮细胞凋亡成为抗血管形成治疗的一种重要的方式。肝素是一种含有长短不一的酸性粘多糖,由葡萄糖胺和葡萄糖醛酸交联而成的粘多糖酯,含有大量硫酸基和羧基,带大量负电荷呈强酸性。研究发现肝素能够抑制VEGF和FGFs刺激血管内皮细胞的增殖和血管的形成,以及影响纤维蛋白凝集的结构,改变纤溶酶原激活物的敏感性。因此,肝素有良好的抗肿瘤血管形成、抗肿瘤生长作用,同时能降低细胞粘附,减少肿瘤浸润、转移。因此,肝素尤其低分子肝素作为一类新的抗肿瘤药物应用于临床有良好的应用前景。肝素作为一种生物大分子,可以作为纳米药物的载体,也可以作为一种抑制肿瘤血管生成和抗肿瘤作用的药物。研究显示,RGD肽是一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)的短肽,为αvβ3整合素受体识别,环形RGD多肽由于多价态可以同时和几个αvβ3结合,因此较线形RGD多肽有更高的受体结合特异性。K237肽是从噬菌体中分离出来的小分子多肽,与VEGFR2有着高度的亲和力,可以干扰VEGF-VEGFR2的结合。通过干扰VEGF与VEGFR2的结合,K237肽能抑制原代培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖。RGD肽和K237肽是短肽,易于进行化学修饰,能够与肝素结合自组装成纳米药物,拮抗血管生成作用靶点VEGF、VEGFR2及整合素αvβ3。然而正常血管内皮细胞也表达VEGFR2,削弱纳米药物的对肿瘤细胞的特异性。为了解决这个问题,我们在纳米药物中引入靶向肿瘤细胞的基团。生物素(Biotin)又称为维生素H,作为酶的辅助因子参与机体碳水化合物、脂类、蛋白质和核酸的代谢,还参与信号传导、基因表达等。生物素通过细胞表面的多维生素转运体(sodium dependent multivitamin transporter,SMVT),内吞入细胞发挥生理作用,肿瘤细胞的快速增殖需要大量生物素,因此纳米药物中引入生物素能够增加其对肿瘤细胞的靶向特异性。本研究以肝素为载体,与Biotin、K237短肽、RGD环肽通过化学方法结合,制备自组装的多靶点纳米药物,以血管内皮细胞、卵巢癌细胞为对象,考察对纳米药物的抗血管生成、抑制肿瘤细胞增殖等作用,并探索自组装纳米药物的作用机制,为开发有效的抗血管生成药物应用于卵巢癌研究,提供研究基础。第一章 多靶点抗血管生成纳米药物的制备和筛选目的：制备稳定的不同含量配比的多靶点纳米药物,筛选出靶向性最好的多靶点纳米药物。方法：1.三种不同含量配比的多靶点纳米药物的制备丁二酰化肝素溶于2 mL无水DMSO中,室温下搅拌至充分溶解,依次加入生物素(Biotin)、环肽RGD、K237、EDC、NHS,室温下搅拌反应后,在水中透析48 h除去DMSO,得多靶点纳米药物。带有荧光探针Oregon Green的多靶点纳米药物制备方法与其一致。40C冰箱保存,并进行理化性质测定。(NP1、NP2和NP3合成中丁二酰化肝素含量不同,分别是40mg、50mg和60mg,余材料加入量相同。)2.三种不同含量配比的多靶点纳米药物的理化性质测定用Zetasizer Nano-Zs动态光散射仪(DLS,英国Malvern公司)测定NP1、NP2和NP3的粒径和电位,通过透射电镜观察纳米药物的形态。3.激光共聚焦显微镜下定性分析脐静脉内皮细胞和卵巢癌细胞对不同靶点含量配比的抗血管生成纳米药物摄取情况分别用等量不同靶点含量配比的抗血管生成纳米药物作用于脐静脉内皮细胞(HUVEC)和卵巢癌细胞(OVCAR-3和SKOV-3),孵育4h后,用Hochest33342染核后,激光共聚焦显微镜观察细胞内纳米分布情况。4.流式细胞仪定量分析脐静脉内皮细胞和卵巢癌细胞对不同靶点含量配比的抗血管生成纳米药物摄取情况将等量不同靶点含量配比的Oregon green绿色荧光标记的抗血管生成纳米药物作用于HUVEC、OVCAR-3和SKOV-3细胞,孵育4h后,流式细胞仪定量测定这三种细胞对靶点含量配比不同的抗血管生成纳米药物的摄取情况。结果：1.制备得到的多靶点纳米粒在透射电镜下观察纳米粒呈规则球形,大小均一,无明显聚集现象。动态光散射仪显示多靶点纳米粒NP1粒径约为56±7 nm,电位约为-27±4mV; NP2粒径约为63±7 nm,电位约为-28±3mV; NP3粒径约为80±7 nm,电位约为-29±3 mV。2.激光共聚焦显微镜下定性分析细胞对不同含量配比的多靶点纳米粒摄取情况：在脐静脉内皮细胞和卵巢癌细胞中,带绿色荧光的多靶点纳米粒主要分布在细胞质中,说明多靶点纳米粒能够靶向脐静脉内皮细胞和卵巢癌细胞并进入细胞中。3.流式细胞仪定量分析细胞摄取情况：在多靶点纳米粒中,荧光强度NP1NP2NP3,结果显示NP1的靶向特异性最好。第二章 多靶点抗血管生成纳米药物的功能性实验目的：研究多靶点抗血管生成纳米药物抗血管生成作用和抗肿瘤作用。方法：1、MTT法测定多靶点纳米药物对脐静脉内皮细胞和卵巢癌细胞的毒性效应分别以不同浓度的LMWH和NP1作用于脐静脉内皮细胞和卵巢癌细胞48 h后,MTT法测定各组细胞的相对存活率。2、划痕实验检测多靶点纳米药物对卵巢癌细胞体外迁移的影响分别以相同浓度的LMWH和NP1作用于脐静脉内皮细胞和卵巢癌细胞0 h、6h、12h、24h后,显微镜随机选取三个视野拍照观察。3、Transwell实验检测多靶点纳米药物对卵巢癌细胞体外迁移的影响分别以相同浓度的LMWH和NP1作用于脐静脉内皮细胞和卵巢癌细胞12h后,收小室制片,用显微镜随机选取五个视野拍照并统计处理数据。4、小管形成实验检测体外多靶点纳米药物对血管生成的影响采用CHEMICON in vitro angiogenesis assay (ECM625)试剂盒检测多靶点纳米粒对HUVEC小管形成的影响。分别以LMWH和NP1作用于体外形成的小管,10h后在倒置光学显微镜下观察多靶点纳米粒体体外对血管生成的影响。5、鸡胚尿囊膜血管形成实验测定多靶点纳米粒对血管生成的影响将种蛋培养数天形成鸡胚绒毛尿囊膜血管后,将LMWH(0.3 mg/mL)、NP 1(0.3 mg/mL)分别滴加在玻璃纤维素滤膜上,然后将滤膜加在已经形成的绒毛尿囊膜远心端,继续培养72 h后,观察结果并拍照。6、基质胶栓实验测定体内多靶点纳米药物对血管生成的影响将基质胶和药物混匀后皮下注射于裸鼠双侧背部,14天后取出基质胶栓,拍照观察,并将基质胶栓做免疫组化检测CD34的表达。7、免疫组化测定基质胶栓中CD34的表达为进一步定性分析纳米药物体内抑制肿瘤新生血管生成的能力,将基质胶栓组织和裸鼠皮下成瘤组织行免疫组化进行血管标记抗体CD34染色,经固定、石蜡包埋、脱蜡、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、血清封闭、抗体孵育、DAB显色、复染、透明、封片等步骤后,正置光学显微镜下观察染色情况并比较三组血管标记抗体CD34表达情况有无差异并分析差异有无统计学意义。结果：1、MTT法测定多靶点纳米药物对脐静脉内皮细胞和卵巢癌细胞的毒性效应分别以不同浓度的LMWH和NP1作用于脐静脉内皮细胞和卵巢癌细胞48 h后,MTT法测定各组细胞的相对存活率,结果表明多靶点纳米药物能够明显抑制HUVEC细胞和卵巢癌细胞的增殖,并随着浓度增加,作用增强。2、划痕实验检测多靶点纳米药物对脐静脉内皮细胞和卵巢癌细胞体外迁移的影响分别以相同浓度的LMWH和NP1作用于脐静脉内皮细胞和卵巢癌细胞0 h、6 h、12 h、24 h后,显微镜拍照观察。结果显示多靶点纳米药物能够抑制HUVEC细胞和卵巢癌细胞的迁移。3、Transwell实验检测多靶点纳米药物对脐静脉内皮细胞和卵巢癌细胞体外迁移的影响分别以相同浓度的LMWH和NP1作用于脐静脉内皮细胞和卵巢癌细胞12h后,用显微镜随机选取五个视野拍照并统计处理数据,结果显示多靶点纳米药物能够抑制HUVEC细胞和卵巢癌细胞的迁移。4、小管形成实验检测多靶点纳米药物体外对血管生成的影响采用CHEMICON in vitro angiogenesis assay (ECM625)试剂盒检测多靶点纳米粒对HUVEC小管形成的作用。分别以LMWH和NP1作用于体外形成的小管,10h后在倒置光学显微镜下观察多靶点纳米粒体体外对的血管生成影响。结果表明,在体外,多靶点纳米药物能够明显抑制小管形成,而LMWH基本没有作用。5、鸡胚尿囊膜血管形成实验测定多靶点纳米药物对血管生成的影响将种蛋的中上1/3去壳,培养直到鸡胚绒毛尿囊膜血管形成,将LMWH(0.3 mg/mL)、NP1(0.3 mg/mL)分别滴加在玻璃纤维素滤膜上,然后将滤膜加在已经形成的绒毛尿囊膜远心端,继续培养72 h后,观察结果并拍照。结果表明,NP1能够明显抑制血管生长,效果较LMWH好。6、基质胶栓实验测定多靶点纳米药物体内对血管生成的影响将基质胶和药物混匀后皮下注射于裸鼠双侧背部,7天后取出基质胶栓,拍照观察,结果表明在体内,NP1能够明显抑制血管生长,效果较LMWH好。7、免疫组化测定基质胶栓中的CD34表达基质胶栓从裸鼠体内取出后,石蜡包埋,切片,选取CD34为血管标记行免疫组化染色分析,结果显示：空白对照组和LMWH组的CD34表达量明显多于纳米药物组,说明与LMWH组相比,纳米药物组的血管生成明显减少,进一步证明纳米药物可以抑制体内新生血管的生成。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.31

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