选择性抑制miR-221对卵巢癌细胞增殖、迁移能力的作用
本文关键词：选择性抑制miR-221对卵巢癌细胞增殖、迁移能力的作用
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【摘要】：目的:卵巢恶性肿瘤是女性生殖器常见的恶性肿瘤,因早期症状不典型且缺乏有效诊断方法,70%~80%卵巢癌患者晚期才被确诊,但晚期尚无有效治疗手段且易复发,故卵巢恶性肿瘤的致死率位于妇科恶性肿瘤之首。上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)占卵巢恶性肿瘤85%-90%,成为最常见的卵巢恶性肿瘤。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类小的非编码RNA,通过降解mRNA或直接抑制翻译过程而发挥基因转录后负性调控作用。人们发现包括卵巢癌在内的许多恶性肿瘤中均有miR-221表达水平的异常升高,从而表明miR-221过表达与肿瘤的发生存在关联。血清miR-221水平上调的EOC患者,其miR-221水平与国际妇产科协会EOC分期及肿瘤分级密切相关,血清中高表达miR-221是EOC独立不良预后因素。相关研究显示在人类肝癌、乳腺癌、结肠癌等肿瘤中高水平的miR-221通过对直接靶基因如抑癌基因CDKN_1B(p27~(kip1))、CDKN_1C(p57~(kip2))、MMAC_1(PTEN)转录后负性调控而抑制细胞的凋亡,促进细胞增殖、迁移。目前有研究显示miR-221在不同肿瘤中调控的直接靶基因不同,卵巢癌中miR-221的直接靶基因尚未有报道。但Wurz K等研究结果显示大部分卵巢肿瘤细胞中p27和p57蛋白表达量减少,而且高表达miR-221和miR-222与低p57蛋白水平相关。相关研究表明下调结肠癌及膀胱癌中miR-221水平可抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡。早期卵巢癌患者5年生存率近90%,晚期病人的5年生存率只有20%~30%但卵巢癌早期不易发现直至晚期已有广泛转移才被确诊,卵巢癌患者仍有近80%复发,其中侵袭和转移是导致卵巢癌患者复发的重要因素,故探究卵巢癌细胞侵袭和转移的有关基因及其作用,对阻止卵巢癌的侵袭和转移具有十分重要的意义。miR-221作为致癌基因,在卵巢肿瘤细胞增殖、迁移中发挥着怎样的作用?目前尚未见相关报道。是否可以通过选择性抑制卵巢癌细胞中miR-221基因,阻遏卵巢癌细胞的侵袭和转移,以期望达到控制卵巢癌细胞侵袭、转移的目的。本研究通过体外培养卵巢癌细胞SKOV3,脂质体转染含有miR-221 sponge的质粒,下调卵巢癌细胞SKOV3中miR-221的表达水平,观察其对卵巢癌细胞SKOV3增殖、迁移能力的影响,从而研究miR-221在卵巢癌发生发展中的作用,为卵巢癌的治疗提供新思路。方法:1 按照高纯度质粒小提中量试剂盒说明书中所示步骤提取两种质粒CAG-EGFP-miR-221 sponge、CAG-EGFP,浓缩后测量质粒浓度及纯度。2 将细胞分组:(1)实验组(SKOV3-miR-221 sponge),应用LipofectamineTM2000脂质体转染法转染CAG-EGFP-miR-221 sponge;(2)阴性对照组(SKOV3-N),应用Lipofectamine~(TM)2000脂质体转染法转染CAG-EGFP;(3)空白对照组(SKOV3),无处理。在荧光显微镜下观察转染24h后细胞转染情况。3 Real-time PCR:用SYBRGreen法进行荧光实时定量PCR检测转染48小时后各组基因miR-221的表达量。4 MTS法检测各组SKOV3细胞0h、24h、48h、72h增殖能力。5 细胞划痕实验:“十”字划痕法评估各组SKOV3细胞的迁移能力。6 统计方法:应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。实验数据以均数±标准差((?)±S)表示,多组间均数比较采用单因素方差分析,P0.05表示差异有统计学意义。所有实验重复三次。结果:1 鉴定质粒CAG-EGFP-miR-221 sponge、CAG-EGFP的纯度及浓度两种质粒纯度A260/A280为1.8,浓度在700ng/uL左右。2 转染效果的观察转染CAG-EGFP-miR-221 sponge、CAG-EGFP24h后在倒置荧光显微镜下观察细胞有无绿色荧光,未转染组无荧光,说明转染,观察带有绿色荧光细胞比例。结果显示SKOV3-miR-221 sponge组转染率为70%-80%,SKOV3-N组转染率为60%-70%,SKOV3组无荧光表达。3 Real-time PCR检测各组miR-221的表达水平实时定量PCR对各组细胞转染后48小时后miR-221的表达水平:SKOV3-miR-221spong组1.172±0.025;SKOV3-N组1.852±0.019;SKOV3组1.921±0.023;SKOV3-miR-221 sponge组与SKOV3-N组、SKOV3组相比,miR-221的表达量明显下调,差异有统计学意义(P㩳0.05),SKOV3-N组与SKOV3组相比,差异无统计学意义(P0.05)。4 MTS法检测各组细胞不同时间增殖情况0小时:SKOV3-miR-221 sponge组0.344±0.0318,SKOV3-N组0.370±0.043,SKOV3组0.390±0.047,实验组与对照组相比P0.05,差异无统计学意义;24小时:SKOV3-miR-221 sponge组0.421±0.068,SKOV3-N组0.510±0.041,SKOV3组0.561±0.059;SKOV3-miR-221 sponge组与SKOV3-N组相比P㩳0.05,差异有统计学意义,SKOV3-miR-221 sponge组与SKOV3组相比P㩳0.05,差异有统计学意义,SKOV3-N组与SKOV3组相比P0.05,差异无统计学意义;48小时:SKOV3-miR-221 sponge组0.518±0.0499,SKOV3-N组0.614±0.035,SKOV3组0.709±0.038,实验组与对照组相比P㩳0.05,差异有统计学意义;72小时:SKOV3-miR-221 sponge组0.5827±0.091,SKOV3-N组0.719±0.026,SKOV3组0.816±0.038,实验组与对照组相比P㩳0.05,差异有统计学意义。5 细胞划痕实验检测各组细胞的迁移能力Image J软件分析划痕实验结果,计算划痕后24小时迁移率:SKVO3-miR-221 sponge组(17.39±5.28)%;SKOV3-N组(24.55±2.641)%;SKOV3组(21.01±3.74)%;实验组与对照组比较P㩳0.05,差异有统计学意义。结论:1下调miR-221可显著降低卵巢癌细胞SKVO3的增殖能力。2下调miR-221可显著降低卵巢癌细胞SKVO3的迁移能力。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.31
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