LSD1介导的表观遗传学修饰促进卵巢癌细胞的迁移及侵袭

发布时间：2018-01-16 03:31

  本文关键词：LSD1介导的表观遗传学修饰促进卵巢癌细胞的迁移及侵袭　出处：《江苏大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的:LSD1参与多种肿瘤的发生发展,有报道称LSD1在卵巢癌组织中过表达,且与患者的不良预后相关,本论文主要研究了LSD1在卵巢癌细胞转移中的作用以及LSD1调控卵巢癌细胞转移的机制。方法:本研究用慢病毒转染的方法,构建LSD1稳定表达的细胞株。首先,扩增慢病毒转染所需的相关质粒,提取质粒DNA;然后使用转染试剂将质粒转染至293T细胞后收集病毒液,再用病毒液感染HO8910细胞,最后加puromycin筛选稳定转染的细胞,并用Western blot及实时定量PCR方法验证稳定转染细胞(LSD1-KD/OE-HO8910)是否成功构建。在体外运用Transwell实验来研究LSD1对于卵巢癌细胞迁移及侵袭的影响。将卵巢癌细胞重悬于含Dox或者TCP的无血清培养基中,种于Transwell小室中。向下室中加入含10%FBS的培养基做诱导剂,培养18 h后观察有细胞穿到小室底膜上,加4%多聚甲醛固定30 min,然后0.1%结晶为研究LSD1对于EMT的调控作用,将LSD1-KD/OE-HO8910加不同浓度的Dox培养48 h后,提取总蛋白,用Western blot的方法检测EMT相关蛋白的标记。为深入研究LSD1对于E-cadherin的调控作用,采用染色质免疫共沉淀的方法。收集大皿中的LSD1-KD-HO8910细胞,在体外用多聚甲醛固定交联蛋白,SDS裂解液重悬交联细胞,超声,蛋白G琼脂糖去除非特异性结合,加H3K4me2抗体孵育过夜,蛋白G琼脂糖收集免疫复合物,20%SDS紫染色15 min,最后显微镜下观察穿到小室膜上的细胞,并统计细胞数目。洗脱,然后65℃逆转复合物,最终得到纯化的DNA,用实时定量PCR检测E-cadherin启动子区域H3K4me2的表达情况,从而确定LSD1是否以表观遗传的方式调控E-cadherin的表达。结果:我们用慢病毒转染的方法构建了LSD1稳定过表达的细胞株(LSD1-OE-HO8910)和LSD1稳定knockdown的细胞株(LSD1-KD-HO8910),作为研究LSD1对卵巢癌细胞迁移及侵袭作用的细胞模型。通过蛋白及RNA两个水平验证,LSD1-KD-HO8910细胞的LSD1表达水平以Dox浓度依赖的形式降低,而在LSD1-OE-HO8910细胞中LSD1的表达则随Dox浓度的增加而上调。Transwell实验的结果显示,在LSD1-KD-HO8910细胞干扰LSD1能使细胞的迁移及侵袭能力降低;此外,TCP(LSD1酶活性抑制剂)可以抑制HO8910细胞迁移及侵袭能力;然而过表达LSD1(LSD1-OE-HO8910细胞)能使HO8910细胞的迁移及侵袭能力增加。这些结果表明LSD1在H08910细胞迁移及侵袭中扮演重要的角色。Western blot检测EMT相关蛋白的实验结果显示,抑制LSD1(sh-LSD1及TCP)明显上调上皮标志基因E-cadherin的表达,同时下调间质标志基因N-cadherin,Vimentin,MMP-2及转录因子Snail的表达。然而在LSD1-OE-HO8910细胞中过表达LSD1产生相反的效果。考虑到干扰LSD1会上调E-cadherin的表达(蛋白及mRNA水平),我们推测LSD1可能通过去除组蛋白H3K4甲基化,从而调控E-cadherin表达。为证实这一假设,我们用染色质免疫沉淀(ChIP)实验来研究LSD1是否以表观遗传的方式调控E-cadherin表达。结果表明,干扰LSD1表达能使E-cadherin基因启动子区域的H3K4me2水平增加,证实了我们的猜想。结论:LSD1在卵巢癌细胞迁移中起着重要作用。LSD1通过使E-cadherin启动子区域的H3K4me2去甲基化,从而下调E-cadherin蛋白的表达,进而诱导EMT的发生,最终促进HO8910细胞的迁移。我们的研究结果表明,LSD1可能是转移性卵巢癌潜在的治疗靶标。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of LSD1 on ovarian cancer cell migration and invasion of ovarian cancer cells by using the method of Western blot . The expression of E - cadherin was regulated by Western blot . The results showed that LSD1 could regulate E - cadherin expression by removing histone H3K4 . The results showed that LSD1 could regulate E - cadherin expression by removing histone H3K4 .

【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.31

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本文编号：1431385