酒精和铅联合作用对胎鼠脑新皮质神经干细胞自我更新和凋亡的影响研究

发布时间：2018-01-16 20:06

本文关键词：酒精和铅联合作用对胎鼠脑新皮质神经干细胞自我更新和凋亡的影响研究　出处：《复旦大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：随着现代社会的发展和人们生活水平的提高,饮酒成为社会交往过程中必不可少的一项环节。孕期饮酒可导致胎儿酒精综合征(fetal alcohol syndrome, FAS)和胎儿酒精谱系障碍(fetal alcohol spectrum disorders, FASD),神经系统发育异常为主要表现之一。铅是一种强烈的的神经毒物,发育中的中枢神经系统是铅的主要靶器官,出生前铅暴露对大脑发育、功能和行为等均存在不良影响。神经干细胞是不成熟的细胞,具有自我更新和多向分化潜能,对中枢神经系统的发育和成熟有着重要的作用。自我更新是指神经干细胞处于未分化状态,并且保持不断增殖的特性,而多向分化潜能是指神经干细胞在适当的诱导条件下能够分化为神经系统几乎所有细胞类型的能力。铅在环境中普遍存在,饮酒又是广泛关注的社会问题,铅与酒精均能干扰神经干细胞自我更新和分化,影响神经系统的正常发育和功能。本课题从孕14天SD大鼠的胎鼠脑皮质分离纯化神经干细胞,研究酒精和铅联合作用对胎鼠脑新皮质神经干细胞自我更新和凋亡的影响和可能机制,以期为其作用机制的阐明提供科学依据。第一部分酒精和铅联合作用对胎鼠脑新皮质神经干细胞自我更新的影响及机制研究1.酒精和铅联合作用对胎鼠脑新皮质神经干细胞存活率的影响利用台盼蓝拒染法检测酒精和醋酸铅联合染毒对胎鼠脑新皮质神经干细胞存活率的影响。与对照组相比,各酒精和铅单独染毒组神经干细胞存活率差异均无统计学意义(P0.05),联合染毒组差异均有统计学意义(P0.05,P0.01)。与同剂量酒精组对比,各联合组细胞存活率呈现明显的下降趋势,且25mM+0.1μM组25mM+1μM组、50mM+0.1μM组和50mM+11μM组差异有统计学意义(P0.05,P0.01)。与同剂量铅染毒组相比,0.01μM铅联合组细胞存活率无显著性改变(P0.05)；0.1μM和1μM铅与各浓度酒精联合组细胞存活率均呈下降趋势,且25mM+0.1μM组、50mM+0.1μM组和50mM+1μM组差异均有统计学差异(P0.05,P0.01)。二者联合染毒对神经干细胞存活率下降具有协同作用。2.酒精和铅联合作用对胎鼠脑新皮质神经干细胞细胞周期的影响利用流式细胞术检测酒精和醋酸铅联合染毒对神经干细胞细胞周期的影响。结果表明,与对照组相比,1 μM醋酸铅单独组及各联合组神经干细胞Go/G1期细胞比例升高,差异有统计学意义(P0.05,P0.01)。与同剂量酒精组对比,联合组的神经干细胞Go/G!期细胞比例差异均有统计学意义(P0.05,P0.01)。与同剂量铅染毒组相比,联合组的神经干细胞Go/G,期细胞比例均呈增加趋势,差异均有统计学意义(P0.05,P0.01)。二者联合染毒对神经干细胞Go/G1期细胞比例增加有协同作用。与对照组相比,酒精单独组和0.1、11.tM醋酸铅单独组及各联合组神经干细胞S期细胞比例均下降,差异有统计学意义(P0.05,P0.01)。与同剂量酒精组对比,25mM联合组以及50mM+1μM组神经干细胞S期细胞比例均下降,差异有统计学意义(P0.01)。与同剂量铅染毒组相比,0.01μM醋酸铅联合组、0.1μM醋酸铅联合组以及25mM+1μM组神经干细胞S期细胞比例均下降,差异均有统计学意义(P0.05,P0.01)。二者联合染毒对神经干细胞S期细胞比例下降有协同作用。与对照组相比,50mM酒精单独组及其联合组神经干细胞G2/M期细胞比例均降低,差异有统计学意义(P0.05,P0.01)。与同剂量酒精组对比,25mM酒精联合组神经干细胞G2/M期细胞比例下降,且25mM+1μM组差异有统计学意义(P0.05)；50mM酒精联合组神经干细胞G2/M期细胞比例无显著改变(P0.05)。与同剂量铅染毒组相比,0.01μM醋酸铅联合组、0.1μM醋酸铅联合组以及50mM+1μ组神经干细胞G2/M期细胞比例差异均有统计学意义(P0.05,P0.01)。二者联合染毒对神经干细胞G2/M期细胞比例下降有一定的拈抗作用。3.酒精和铅联合作用对胎鼠脑新皮质神经干细胞细胞周期相关调控基因的影响利用荧光定量RT-PCR技术检测细胞周期抑制基因p16、p21和(?)53mRNA的表达。结果表明,与对照组相比,各酒精和铅单独染毒组的p16mRNA表达增加,且50mM酒精组、0.01μM铅单独组和25 mM+0.01μM组差异有统计学意义(P0.05,P0.01)。与同剂量酒精组对比,25 mM+0.01μM组p16 mRNA表达增加,差异有统计学意义(P0.01)；50mM酒精联合组p16 mRNA表达无显著改变(P0.05)。与同剂量铅染毒组相比,0.01μM铅与各浓度酒精联合组p16 mRNA表达显著性增加(P0.05,P0.01);0.1μM和1μM铅与各浓度酒精联合组p16 mRNA表达均无显著改变(P0.05)。低剂量铅和低剂量酒精联合染毒对神经干细胞p16 mRNA表达水平增加存在一定的协同作用,与高剂量酒精联合染毒存在一定的拮抗作用。与对照组相比,50mM+0.01μM组p21 mRNA表达水平显著性增加(P0.01)。与同剂量酒精组对比,25mM酒精联合组p21mRNA表达水平下降,且25mM+0.1μM组25mM+1μM组差异有统计学意义(P0.05)；50mM+0.01μM组p21mRNA表达水平显著性增加(P0.05)。与同剂量铅染毒组相比,0.01μM铅联合组21mRNA表达水平显著性增加(P0.05)；0.1μM+25mM组p21mRNA表达水平显著性下降(P0.05)；1μM+25mM组p21mRNA表达水平下降,差异有统计学差异(P0.05)。二者联合染毒对神经干细胞p21mRNA表达水平主要表现为拮抗作用,高剂量酒精和低剂量醋酸铅联合染毒存在一定协同作用。与对照组相比,各酒精和铅单独染毒组的神经干细胞p53mRNA表达水平呈上升趋势,且0.1μM和1μM铅单独组差异均有统计学意义(P0.05)。与同剂量酒精组对比,25mM+0.01μM组50mM+1μM组p53mRNA表达水平显著性增加(P0.05,P0.01)。与同剂量铅染毒组相比,0.01μM+25mM组p53mRNA表达水平显著性增加(P0.05)；0.1μM铅和1μM铅与各浓度酒精联合组p53mRNA表达水平无显著改变(P0.05)。析因分析结果显示,二者联合染毒其交互作用有统计学意义(P0.01)。但是R2为0.479,该交互作用可认为是统计学意义上的交互作用,而是否存在生物学意义显著仍需进一步试验进行验证。4.酒精和铅联合作用对胎鼠脑新皮质神经干细胞标志物的影响利用荧光定量RT-PCR技术检测神经干细胞标志物Nestin和Sox2 mRNA的表达。结果表明,与对照组相比,50mM酒精单独组、25mM+1μM组和50mM酒精所有联合组NestinmRNA表达水平差异均有统计学意义(P0.05,P0.01)。与同剂量酒精组对比,联合组NestinmRNA表达水平无显著改变(P0.05)。与同剂量铅染毒组相比,联合组NestinmRNA表达水平均下降,且25mM+1μM组以及50mM酒精的所有联合组差异均有统计学意义(P0.05,P0.01)。二者联合染毒对神经干细胞Nestin mRNA表达水平下降有协同作用。与对照组相比,酒精单独染毒组和25mM+1μM组Sox2 mRNA表达下降,差异有统计学意义(P0.05,P0.01)。与同剂量酒精组对比,25mM酒精联合组Sox2mRNA表达水平无显著改变(P0.05)；50mM+1μM组差异有统计学意义(P0.05)。与同剂量铅染毒组相比,0.01μM和0.1μM铅与各浓度酒精联合组Sox2 mRNA表达水平均无显著改变(P0.05)；1gM+25mM组Sox2 mRNA表达水平下降,差异有统计学意义(P0.05)。二者联合染毒对神经干细胞Sox2 mRNA表达水平的影响无交互作用。5.酒精和铅联合作用对胎鼠脑新皮质神经干细胞Wnt通路相关基因表达的影响利用荧光定量RT-PCR技术检测神经干细胞Wnt信号通路相关基因C-myc和CyclinDl mRNA的表达。与对照组相比,铅单独染毒组以及25mM+0.01μM组C-myc mRNA表达水平显著性增加(P0.05,P0.01)。与同剂量酒精组对比,酒精与0.01μM以及0.1μM铅的联合组C-myc mRNA表达水平显著性增加(P0.05,P0.01)。与同剂量铅染毒组相比,0.01μM+25mM联合组C-myc mRNA表达显著性增加；0.1 μM+50mM组和1 μM铅联合组C-myc mRNA表达水平显箸性下降(P0.05,P0.01)。二者联合染毒对神经干细胞C-myc mRNA表达水平主要表现为拮抗作用,低剂量酒精和低剂量醋酸铅联合染毒存在一定的协同作用。与对照组相比,50 mM酒精单独组、1 μM铅单独组和1μM铅联合组CyclinD1 mRNA表达水平显著性增加(P0.05)。与同剂量酒精组对比,50 mM酒精与1 μM铅联合组CyclinD1 mRNA表达水平显著性增加(P0.05,P0.01)。与同剂量铅染毒组相比,1μM+25mM联合组CyclinD1 mRNA表达水平差异有统计学意义(P0.05,P0.01)。二者联合染毒可能对神经干细胞CyclinD1 mRNA表达水平的影响无交互作用。第二部分酒精和铅联合作用对胎鼠脑新皮质神经干细胞凋亡的影响及作用机制研究1.酒精和铅联合作用对胎鼠脑新皮质神经干细胞凋亡的影响利用Annexin V/PI染色流式检测神经干细胞的凋亡率。与对照组相比,各酒精和铅单独染毒组的正常细胞比例差异均无统计学意义(P0.05)；各联合组正常细胞比例呈明显下降趋势,50mM+0.1μM组和50mM+1μM组差异有统计学意义(P0.05)。与同剂量酒精组对比,各联合组正常细胞比例呈现明显下降趋势,且25mM+1μM组和50mM+1μM组差异有统计学意义(P0.05)。与同剂量铅染毒组相比,0.01gM铅联合组差异无统计学差异(P0.05)；50mM组+0.1 μM组和50mM+1μM组正常细胞比例下降,差异有统计学差异(P0.05,P0.01)。二者联合染毒对神经干细胞正常细胞比例的影响无交互作用。与对照组相比,各酒精和铅单独染毒组的早期凋亡细胞比例差异均无统计学意义(P0.05)；50mM+0.1μM组和50mM+1μM组早期凋亡细胞比例增加,差异均有统计学意义(P0.05)。与同剂量酒精组对比,各联合组差异均无统计学意义(P0.05)。与同剂量铅染毒组相比,50mmM酒精联合组早期凋亡细胞比例增加,差异有统计学差异(P0.05)。二者联合染毒对神经干细胞早期凋亡细胞比例的影响无交互作用。与对照组相比,0.01μM和0.1μM铅单独染毒组的晚期凋亡细胞比例增加,差异有统计学意义(P0.05)；50mM酒精和醋酸铅联合染毒组晚期凋亡细胞比例呈明显的下降趋势,差异均有统计学意义(P0.05)。与同剂量酒精组对比,各联合组晚期凋亡细胞比例差异均无统计学意义(P0.05)。与同剂量铅染毒组相比,各联合组晚期凋亡细胞比例差异均无统计学意义(P0.05)。二者联合染毒对神经干细胞晚期凋亡细胞比例有交互作用,25mM酒精组联合表现为拮抗作用,50mM酒精联合组表现为协同作用。2.酒精和铅联合作用对胎鼠脑新皮质神经干细胞凋亡相关基因的影响本研究于神经干细胞染毒48小时后收集神经球,利用荧光定量RT-PCR技术检测了凋亡抑制基因Bcl-2和Survivin、促凋亡基因Bax以及凋亡效应基因Caspase3 mRNA的表达。与对照组相比,酒精和铅单独染毒组以及联合染毒组神经干细胞Caspase3 mRNA表达水平差异均无统计学意义(P0.05)。与同剂量酒精组对比,酒精与各浓度铅联合组神经干细胞Caspase3 mRNA表达水平差异均无统计学意义(P0.05)。与同剂量铅染毒组相比,铅与各浓度酒精联合组神经干细胞Caspase3 mRNA表达水平差异均无统计学意义(P0.05)。二者联合染毒对神经干细胞Caspase3 mRNA表达水平的影响无交互作用。与对照组相比,酒精和铅单独染毒组以及联合染毒组神经干细胞5ax mRNA表达水平差异均无统计学意义(P0.05)。与同剂量酒精组对比,25mM酒精组差异无统计学意义(P0.05)；50mM+1μM组Box mRNA表达水平增加,差异有统计学意义(P0.05)。与同剂量铅染毒组相比,0.01μM和0.1μM铅与酒精联合组神经干细胞Box mRNA表达水平差异均无统计学意义(P0.05);50mM+1μM组显著性降低(P0.05)。二者联合染毒对神经干细胞Box mRNA表达水平的影响无交互作用。与对照组相比,50mM酒精单独组以及50mM酒精联合组神经干细胞Bcl-2mRNA表达水平下降,差异有统计学意义(P0.05)。与同剂量酒精组对比,25mmM酒精联合组神经干细胞Bcl-2 mRNA表达水平呈下降趋势,且25mM+1μM组差异有统计学意义(P0.05)。与同剂量铅染毒组相比,0.01μM和0.1μM铅与酒精联合组差异均无统计学意义(P0.05)；1μM铅与各浓度酒精联合组神经干细胞Bcl-2 mRNA表达水平呈明显的下降趋势,差异有统计学意义(P0.01)。二者联合染毒对神经干细胞Bcl-2 mRNA表达水平的影响无交互作用。与对照组相比,酒精和铅单独染毒组以及所有联合组的神经干细胞Survivin mRNA表达水平显著下降,差异均有统计学意义(P0.05,P0.01)。与同剂量酒精组对比,各联合组Survivin mRNA表达水平差异均无统计学意义(P0.05)。与同剂量铅染毒组相比,各联合组SurvivinmRNA表达水平差异均无统计学意义(P0.05)。二者联合染毒对神经干细胞Survivin mRNA表达水平下降有拮抗作用。综上所述,酒精和醋酸铅联合染毒抑制神经干细胞自我更新,促进神经干细胞出现凋亡事件,二者联合作用类型主要表现为协同作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R714.5

【参考文献】