血管内皮生长因子111b对卵巢癌血管生成和生长的作用及相关机制研究

发布时间：2018-01-29 02:47

  本文关键词： 血管内皮生长因子111b 卵巢癌 血管生成 增殖 血管内皮生长因子受体　出处：《中国人民解放军医学院》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景 卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，其发病率和病死率逐年升高，5年生存率仍仅为20%-30%。初步研究VEGF基因差异剪接后能够产生表达8a外显子的VEGFxxx亚家族，具有促进血管生成的活性；表达8b外显子的VEGFxxxb亚家族，具有抑制血管生成的活性。Mineur等报道了一种新的VEGFxxx亚家族成员VEGF111，证实其能够通过激活VEGFR2促进血管生成，那么是否存在相对应的VEGF111b剪接变异体至今尚未被证实。 研究目的 1.证实VEGF111b存在，构建VEGF111b真核表达系统； 2.研究VEGF111b对卵巢癌血管生成的作用并探讨其作用机制； 3.研究VEGF111b对卵巢癌生长的作用并探讨其作用机制。 研究方法 1.应用RT-PCR方法从丝裂霉素C处理过的人卵巢癌SKOV3细胞中扩增出VEGF111b基因，将之连接至pcDNA3.1质粒构建VEGF111b真核表达载体； 2.使用VEGF111b特异性抗原肽CRSLTRKD制备VEGF111b多克隆抗体，应用RT-PCR和Western blot检测方法证实VEGF111b基因及蛋白在卵巢癌细胞中诱导性表达； 3.使用LipofectaminTM2000将VEGF111b转染卵巢癌细胞，通过G418压力筛选稳定转染株，应用Western blot方法检测卵巢癌细胞内及上清液中VEGF111b蛋白的过表达； 4.应用MTT比色法检测VEGF111b对血管内皮细胞及卵巢癌细胞增殖能力的影响； 5.应用“划痕”迁移实验和Transwell小室检测VEGF111b对血管内皮细胞迁移能力的影响； 6.应用小管形成实验检测VEGF111b对血管内皮细胞小管形成能力的影响； 7.应用Western blot方法检测VEGF111b抑制血管生成的机制及信号通路； 8.应用细胞平板克隆形成实验检测VEGF111b对卵巢癌细胞长期增殖能力的影响； 9.应用细胞DNA含量检测（细胞周期实验）检测VEGF111b对卵巢癌细胞周期的影响； 10.制备稳定转染VEGF111b人卵巢癌细胞SKOV3荷瘤裸鼠模型，观察裸鼠移植瘤生长情况，接种后20天剥离移植瘤称重。应用免疫组织化学染色法检测增殖蛋白Ki67和PCNA，血管化蛋白VEGF和CD31的表达情况。 研究结果 1.证实了VEGF111b基因在丝裂霉素C处理的卵巢癌细胞中存在，从中扩增出VEGF111b基因，并连接至pcDNA3.1质粒，经过双酶切鉴定及克隆测序鉴定，，成功构建了VEGF111b真核表达载体，测序结果与预测完全相符； 2.成功制备了VEGF111b多克隆抗体，并证实VEGF111b蛋白在卵巢癌细胞中诱导性表达； 3.制备了VEGF111b稳定转染的卵巢癌细胞株，并证实VEGF111b蛋白在卵巢癌细胞内及上清液中过表达； 4. VEGF111b显著抑制血管内皮细胞的增殖，24h和48h增殖抑制率分别达到26±8%和38±10%； 5.细胞“划痕”迁移实验VEGF111b显著抑制血管内皮细胞的迁移距离，8h和16h抑制率分别为43%±11%和61%±13%；Transwell实验VEGF111b显著抑制血管内皮细胞的迁移数量，抑制率为28%±7%； 6. VEGF111b显著抑制血管内皮细胞的小管形成能力； 7. VEGF111b抑制血管内皮细胞膜上的VEGF-R2磷酸化，及其下游信号传导分子ERK1/2、PI3K和Akt1的磷酸化； 8. VEGF111b显著抑制卵巢癌细胞的增殖，对SKOV3细胞48h和72h增殖抑制率分别达到40±7%和50±11%，对OVCAR3细胞48h和72h增殖抑制率分别达到25±10%和42±12%； 9. VEGF111b明显抑制SKOV3和OVCAR3细胞的克隆形成； 10. VEGF111b使卵巢癌细胞阻滞在S期； 11. VEGF111b抑制卵巢癌细胞膜上的VEGF-R2磷酸化，及其下游信号传导分子ERK1/2、PI3K和Akt1的磷酸化； 12. VEGF111b显著抑制卵巢癌细胞裸鼠皮下移植瘤的生长，VEGF111b组移植瘤组织细胞胞核增殖蛋白Ki67和PCNA着色明显减弱，胞浆血管化蛋白VEGF和CD31着色明显减弱。 结论 1.发现了一个新的VEGF剪接异构体—VEGF111b基因，成功获得了VEGF111b基因序列。 2.成功制备了VEGF111b多克隆抗体,证实VEGF111b基因及蛋白在卵巢癌细胞SKOV3及OVCAR中诱导性表达。 3. VEGF111b抑制血管内皮细胞的增殖、迁移及小管形成能力，抑制血管生成。 4. VEGF111b通过与内皮细胞表面的VEGF-R2结合并抑制其磷酸化，进而抑制其下游信号传导分子PI3K/Akt1和ERK1/2的磷酸化，从而抑制血管生成活性。 5. VEGF111b显著抑制卵巢癌细胞的增殖能力，抑制肿瘤生长 6. VEGF111b使卵巢癌细胞阻滞在S期。 7. VEGF111b通过与内皮细胞表面的VEGF-R2结合并抑制其磷酸化，进而抑制其下游信号传导分子PI3K/Akt1和ERK1/2的磷酸化，从而抑制卵巢癌细胞的增殖。 8. VEGF111b显著抑制卵巢癌细胞裸鼠皮下移植瘤的生长，与抑制体内成瘤的增殖和血管生成有关。
[Abstract]:Research background
Ovarian cancer is one of the most common gynecologic malignant tumors, the incidence rate and mortality rate increased year by year, the 5 year survival rate is only 20%-30%. of VEGF gene alternative splicing can produce VEGFxxx subfamily expression of 8A exons, can promote angiogenesis activity; VEGFxxxb subfamily expression of exon 8b, with anti angiogenesis activity.Mineur reported that a new VEGFxxx subfamily VEGF111, confirmed its ability to promote angiogenesis through the activation of VEGFR2, so the existence of corresponding splice variants of VEGF111b has not yet been confirmed.
research objective
1. the existence of VEGF111b was confirmed and the VEGF111b eukaryotic expression system was constructed.
2. to study the effect of VEGF111b on the angiogenesis of ovarian cancer and to explore the mechanism of its action.
3. to study the effect of VEGF111b on the growth of ovarian cancer and to explore the mechanism of its action.
research method
1., RT-PCR method was used to amplify the VEGF111b gene from human ovarian cancer SKOV3 cells treated with mitomycin C, and then connect it to pcDNA3.1 plasmid to construct eukaryotic expression vector of VEGF111b.
2., we used VEGF111b specific antigen peptide CRSLTRKD to prepare VEGF111b polyclonal antibody. RT-PCR and Western blot assay were used to confirm VEGF111b gene and protein expression in ovarian cancer cells.
3., VEGF111b was transfected into ovarian cancer cells by LipofectaminTM2000. The stable transfected strain was screened by G418 pressure. Western blot method was applied to detect the over expression of VEGF111b protein in ovarian cancer cells and supernatants.
4. MTT colorimetric assay was used to detect the effect of VEGF111b on the proliferation of vascular endothelial cells and ovarian cancer cells.
5. the effect of VEGF111b on the mobility of vascular endothelial cells was detected by the "scratch" Migration Experiment and the Transwell compartment.
6. the effect of VEGF111b on the formation ability of vascular endothelial cells was detected by microtubule formation.
7. the Western blot method was used to detect the mechanism and signal pathway of VEGF111b to inhibit angiogenesis.
8. the effect of VEGF111b on the long-term proliferation of ovarian cancer cells was detected by cell clones.
9. DNA assay (cell cycle test) was used to detect the effect of VEGF111b on the cell cycle of ovarian cancer.
10. prepare stable transfected VEGF111b human ovarian cancer cell SKOV3 nude mice model. Observe the growth of transplanted tumor in nude mice. After 20 days, the transplanted tumor was weighed. The expression of proliferating protein Ki67 and PCNA, VEGF and CD31 were detected by immunohistochemical staining.
Research results
1. confirmed the presence of VEGF111b gene in the treatment of mitomycin C in ovarian cancer cells, VEGF111b gene was amplified from, and connected to the pcDNA3.1 plasmid. After double enzyme digestion and sequencing identification, successfully constructed VEGF111b eukaryotic expression vector and sequencing results are consistent with the prediction;
2. the VEGF111b polyclonal antibody was successfully prepared and the inducible expression of VEGF111b protein in ovarian cancer cells was confirmed.
3. the VEGF111b stably transfected ovarian cancer cell lines were prepared, and the expression of VEGF111b protein in ovarian cancer cells and supernatant was confirmed.
4. VEGF111b significantly inhibited the proliferation of vascular endothelial cells, and the proliferation inhibition rates of 24h and 48h were 26 + 8% and 38 + 10%, respectively.
5. cell "scratch" Migration Experiment VEGF111b significantly inhibited the migration distance of vascular endothelial cells, and the inhibition rates of 8h and 16h were 43% + 11% and 61% + 13% respectively. Transwell test VEGF111b significantly inhibited the migration of vascular endothelial cells, and the inhibition rate was 28% + 7%.
6. VEGF111b significantly inhibited the tubule formation ability of vascular endothelial cells.
7. VEGF111b inhibits the phosphorylation of VEGF-R2 on the membrane of vascular endothelial cells, and the phosphorylation of the downstream signal transduction molecules ERK1/2, PI3K and Akt1;
8. VEGF111b significantly inhibited the proliferation of ovarian cancer cells, and the proliferation inhibition rates of SKOV3 cells 48h and 72h were 40 + 7% and 50 + 11% respectively, and the inhibition rates on 48h and 72h of OVCAR3 cells were 25 25, 10% and 42 12%, respectively.
9. VEGF111b obviously inhibited the cloning and formation of SKOV3 and OVCAR3 cells.
10. VEGF111b block ovarian cancer cells in S stage.
11. VEGF111b inhibits the phosphorylation of VEGF-R2 on the membrane of ovarian cancer cells, and the phosphorylation of the downstream signal transduction molecules ERK1/2, PI3K and Akt1;
12. VEGF111b significantly inhibited the growth of ovarian cancer cells in nude mice. The expression of proliferating protein Ki67 and PCNA in VEGF111b group was significantly decreased, and the expression of VEGF and CD31 in cytoplasm was significantly weakened.
conclusion
1. a new VEGF splicing isomer, VEGF111b gene, was discovered and the VEGF111b gene sequence was successfully obtained.
2. successfully prepared VEGF111b polyclonal antibody and confirmed that VEGF111b gene and protein were inducible expression in SKOV3 and OVCAR of ovarian cancer cells.
3. VEGF111b inhibits the proliferation, migration and tubule formation of vascular endothelial cells and inhibits angiogenesis.
4., VEGF111b binds with the VEGF-R2 on the endothelial surface and inhibits its phosphorylation, thereby inhibiting the phosphorylation of downstream signaling molecules PI3K/Akt1 and ERK1/2, thereby inhibiting angiogenesis.
5. VEGF111b significantly inhibits the proliferation of ovarian cancer cells and inhibits tumor growth
6. VEGF111b block ovarian cancer cells in S phase.
7., VEGF111b can bind to the VEGF-R2 on the endothelial surface and inhibit its phosphorylation, thereby inhibiting the phosphorylation of downstream signaling molecules PI3K/Akt1 and ERK1/2, thereby inhibiting the proliferation of ovarian cancer cells.
8. VEGF111b significantly inhibits the growth of subcutaneous transplanted tumor in nude mice of ovarian cancer cells, which is related to the inhibition of tumor proliferation and angiogenesis in the body.

【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.31

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本文编号：1472293