低剂量十溴联苯醚孕期及哺乳期暴露对胎盘NO和ET-1及子鼠海马cofilin-1和Vimentin的影响

发布时间：2018-02-25 23:20

本文关键词： 十溴联苯醚内皮素-1 内皮型一氧化氮合酶一氧化氮胎盘动物卤代二苯醚类母亲暴露肌动蛋白解聚因子类波形蛋白学习记忆动物新生　出处：《广州医科大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：【背景】 1.多溴联苯醚（Polybrominated diphenyl ethers，PBDEs）概述溴系阻燃剂近年来得到越来越多学者的关注与研究。多氯联苯醚（Polychlorinatedbiphenyls，PCBs）是应用最早的阻燃剂，被广泛应用于电介质，如电容器、变压器和电动马达中。但因为发现这类阻燃剂是一种持久性有机污染物，会对环境及人体造成毒害作用，因此美国国会和针对持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约分别于1979年和2001年禁止了PCBs的生产。多溴联苯醚（Polybrominated diphenyl ethers，PBDEs）是一系列含有溴原子的芳香族化合物，它与多氯联苯醚具有相类似的化学结构，作为多氯联苯醚的替代品，多溴联苯醚具有优异的阻燃性能。PBDEs可在高温状态下释放自由基，从而阻断燃烧反应，因此在产品制造过程中，PBDEs常被用于添加到复合材料中，以提高产品的防火性能。一般将十溴联苯醚（decabrominated diphenyl ether，PBDE-209）以下低溴含量的各类多溴联苯醚称为低溴联苯醚，只有PBDE-209是一个完全溴化的多溴联苯醚品种。工业化生产的多溴联苯醚中，最常用的为五溴、八溴和十溴联苯醚三个品种。已有研究发现，多溴联苯醚的溴化程度越低，其燃烧时生成二恶英的机率越大，毒性越高。低溴联苯醚能更有效地在生物体内积累，影响甲状腺的激素水平，并具有较高的生殖及神经系统毒性。2009年5月，《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》中，四溴、五溴、六溴、七溴及八溴联苯醚被列入受控名单范围内。PBDE-209是多溴联苯醚家族中含溴原子数最多的一类化合物，，由于它价格低廉、性能优越且急性毒性在所有溴联苯醚中最低，因此在全球范围内使用最为广泛，已越来越广泛的应用于各种消费产品中，包括建材、家具、电子、汽车、塑料、飞机、聚氨酯泡沫和纺织品等。据统计，PBDE-209占阻燃剂总量的75%以上。 2.多溴联苯醚的物理化学性质 PBDEs的化学通式是C12H(0-9)Br(1-10)O，其中溴原子和氢原子之和为10（结构式如图1）。依据苯环上溴原子位置和取代数目的不同，共有四溴联苯醚、五溴、六溴、八溴、十溴等209种同系物，分子量自249到959不等。PBDEs高温下可释放溴原子从而驱散电子，起到灭火功能，高溴化PBDEs在光照下可形成低溴化PBDEs。PBDEs的沸点在310～425℃之间，挥发性较小，当吸附于颗粒物上或进入大气环境中后，会跟随大气环流进行长距离的迁移，并且迁移距离随着溴原子数的增加而减少。PBDEs的化学性质非常的稳定，难以通过化学、物理或生物等方式进行降解。正因如此，PBDEs一旦进入环境体系,就可在土壤、水体及底泥等环境介质中存留数年,甚至更长的时间。几种主要的PBDEs的基本性质见下表1。 PBDE-209的分子式：C12Br10O，分子量为959.17，不溶于水及一般有机溶剂。高温时溶于甲苯，二甲苯。理论含溴量83.3%。十溴联苯醚的热稳定性非常好，适用于要求加工温度高的聚合物，被广泛应用于塑料制品、电路板和建筑材料等领域的阻燃剂。2001年，全世界PBDE-209的年需求量估计为56,100吨，其中美洲占24,500吨，亚洲23,000吨，欧洲为7,600万吨。值得注意的是，环境中PBDE-209可脱溴降解为毒性更强的四溴、五溴及八溴联苯醚（图2）。这种脱溴作用可能是通过“生物”或“非生物”途径完成的。PBDE-209与其它PBDEs相同，均具有环境持久性、难降解性、强亲脂性、环境稳定性、生物富集性和高生物毒性等特征，其已成为一类新型持久性有机污染物(Persistent Organic Pollutants, POPs)。 3.多溴联苯醚的生物毒性效应对PBDEs具有生物毒性的猜测始于PBDEs的分子结构（见图1）和化学性质与PCBs相似（图3），而PCBs对生物健康有明显的影响已被证实。有学者提出，PBDEs与PCBs对生物体有相似的内分泌干扰作用，可改变机体内血液中甲状腺激素的动态平衡，并可影响维生素A的储备量，而这些因素的改变又将会导致生物体的免疫能力、发育和繁殖能力及其它一些生理生化过程发生相应的改变。研究表明，PBDEs主要是对人和动物产生甲状腺毒性、神经毒性、生殖毒性和内分泌干扰作用，对实验动物还有致癌性。十溴联苯醚(Decabrominated Diphenyl Ether，PBDE-209)是一种环境持久性有机污染物，妊娠期暴露会在母体内蓄积，并可以通过胎盘、脐血及母乳对新生儿结局及子代远期生长发育产生不良影响。第一部分低剂量十溴联苯醚孕期暴露对胎盘NO和ET-1的影响【目的】建立低剂量PBDE-209孕期暴露SD（Sprague Dawley, SD）大鼠模型，通过检测孕鼠胎盘内皮素-1(endothelin-1，ET-1)基因及内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）基因的mRNA表达水平，胎盘组织ET-1、eNOS及总一氧化氮（Nitric oxide，NO）表达水平，仔鼠出生体重以评估PBDE-209孕期暴露对母鼠胎盘的影响。【材料与方法】 1.购买10周龄SD雌性大鼠40只，雄性大鼠20只，饲养于广州医科大学动物实验中心SPF级动物房内。将雌雄大鼠按2：1合笼（每笼3只），头天傍晚5点将雌鼠放入雄鼠笼中，次日晨9点前取出，雌鼠进行阴道分泌物涂片检查，将分泌物涂于干净载玻片上，倒置显微镜下见雄鼠精子满视野视为妊娠第1日，取出单独饲养，未孕者仍与雄鼠合笼，直至受孕。 2.将妊娠第1天的10周龄雌性SD大鼠40只随机分成5组，每组8只，A组：空白对照组（正常饲养组）；B组：精炼花生油5ml/（kg·d）灌胃；C组、D组及E组分别给予1、5及10mg/（kg·d）十溴联苯醚灌胃（溶于等量精炼花生油）。B组、C组、D组及E组母鼠自妊娠第1天至妊娠第22天每日按上述剂量灌胃。 3.于妊娠第22天下午各组母鼠剖宫产，取胎盘及仔鼠并计数、称重，以初步了解胎盘功能。 4.各组胎盘分成三部分。一部分制成石蜡切片，之后利用免疫组织化学染色法观察胎盘ET-1及eNOS表达情况；一部分锡纸包裹后储于液氮罐中，组织匀浆后利用酶联免疫吸附测定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)检测胎盘中总NO含量；另一部分提取RNA，利用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time quantitative Polymerase Chain Reaction，RT-qPCR）技术，检测胎盘中ET-1基因及eNOS基因mRNA的表达水平。【结果】与A组（6.24±0.384）比较，D组（5.49±0.498）及E组（5.45±0.455）仔鼠平均出生体重下降（P＜0.05）。与A组（1.000±0.000）比较，C组、D组及E组母鼠胎盘组织ET-1mRNA的相对定量值[（1.580±0.039）、（1.680±0.086）及（1.912±0.097）]均升高（t分别＝-21.234、-11.230及-13.358，均P＜0.05）；与A组（1.000±0.000）比较，C组、D组及E组母鼠胎盘组织eNOS mRNA的相对定量值[（0.867±0.019）、（0.792±0.058）及（0.729±0.059）]均下降（t分别＝9.341、4.685及3.537，均P＜0.05）；与A组（1.00±0.00）比较，C组、D组及E组胎盘组织ET-1表达水平[（1.53±0.13）、（2.14±0.21）及（2.57±0.15）]均升高（t分别＝3.152、4.783及5.432，均P＜0.05）；与A组（1.00±0.00）比较，C组、D组及E组胎盘组织eNOS表达水平[（0.82±0.11）、（0.64±0.12）及（0.49±0.20）]均下降（t分别＝5.884、6.873及8.368，均P＜0.05）。与A组（27.179±1.226）比较，D组及E组胎盘组织NO表达水平[（79.744±0.577）及（98.141±1.442）]均升高（t分别＝-77.587及-74.984，均P＜0.05）。【结论】孕期PBDE-209暴露影响胎盘ET-1基因及eNOS基因的表达，从而影响胎盘功能，降低子代出生体重。第二部分低剂量十溴联苯醚孕期及哺乳期暴露对子鼠海马cofilin-1和Vimentin的影响【目的】探讨母鼠妊娠期及哺乳期十溴联苯醚暴露对仔鼠学习记忆能力影响的可能作用机制。【材料与方法】 1.购买10周龄SD雌性大鼠40只，雄性大鼠20只，饲养于广州医科大学动物实验中心SPF级动物房内。将雌雄大鼠按2：1合笼（每笼3只），头天傍晚5点将雌鼠放入雄鼠笼中，次日晨9点前取出，雌鼠进行阴道分泌物涂片检查，将分泌物涂于干净载玻片上，倒置显微镜下见雄鼠精子满视野视为妊娠第1日，取出单独饲养，未孕者仍与雄鼠合笼，直至受孕。 2.将妊娠第1天的10周龄雌性SD大鼠40只随机分成5组，每组8只，A组：空白对照组（正常饲养组）；B组：精炼花生油5ml/（kg·d）灌胃；C组、D组及E组分别给予1、5及10mg/（kg·d）十溴联苯醚灌胃（溶于等量精炼花生油）。B组、C组、D组及E组母鼠自妊娠第1天至仔鼠断乳（分娩后28天）每日按上述剂量灌胃。 3.胃灌结束后，每组随机选取20只仔鼠（雌、雄仔鼠各10只），利用Morris水迷宫试验对其学习记忆能力进行检测。 4. Morris水迷宫试验结束后，每组上述子鼠取海马组织，采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测海马组织丝切蛋白-1（cofilin-1）和波形蛋白（Vimentin）的mRNA及蛋白表达水平。【结果】与A组比较，D组及E组仔鼠平均逃避潜伏期时间延长（P＜0.05）；与A组（1.000±0.000）比较，C组、D组及E组仔鼠海马组织Cofilin-1mRNA的相对定量值[（0.888±0.045）、（0.787±0.041）及（0.610±0.021）]均下降（t分别＝－2.904、－4.555及－3.131，均P＜0.05）；与A组（1.000±0.000）比较，C组、D组及E组仔鼠海马组织Vimentin mRNA的相对定量值[（0.634±0.031）、（0.428±0.022）及（0.291±0.034）]均下降（t分别＝－20.168、－45.852及－36.457，均P＜0.01）；与A组（1.60±0.07）比较，D组及E组仔鼠海马组织Cofilin-1蛋白表达水平[（0.88±0.14）及（0.37±0.13）]均下降（t分别＝3.152及5.432，均P＜0.05）；与A组（1.52±0.20）比较，D组及E组仔鼠海马组织Vimentin蛋白表达水平[（0.51±0.22）及（0.22±0.18）]均下降（t分别＝5.884及8.368，均P＜0.01）。【结论】妊娠期及哺乳期母鼠十溴联苯醚暴露导致仔鼠学习记忆能力下降，其机制可能与海马组织Cofilin-1及Vimentin mRNA及蛋白表达水平下降有关。
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【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R714

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