NEDD9在上皮性卵巢癌恶性生物学行为中的作用及机制的初步研究

发布时间：2018-03-03 01:09

本文选题：NEDD9　切入点：上皮性卵巢癌　出处：《重庆医科大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：卵巢癌是女性生殖系统最常见的三大恶性肿瘤之一，其死亡率高居妇科恶性肿瘤之首，其中，上皮性卵巢癌（Epithelial ovarian cancer，EOC）是卵巢癌最常见的病理类型，约占所有卵巢癌的80%以上。因为卵巢深藏于盆腔，早期发生病变时，患者往往无症状，且由于缺乏早期诊断卵巢癌的有效方法，导致70-75%的患者就诊时已属晚期，已出现了广泛的盆腹腔扩散或远处转移。尽管理想的肿瘤细胞减灭术及铂类为基础的联合化疗方案对卵巢癌患者有效，但治疗效果差，复发率高，且易产生化疗药物耐药，迄今为止，卵巢癌患者的5年生存率仍徘徊在30%左右。卵巢癌的侵袭转移和化疗耐药是临床治疗卵巢癌的难点。因此，寻找高敏感性和特异性的生物学标记物对于阐述调控卵巢癌发生发展的分子网络机制具有十分重要的价值。 NEDD9(Neural precursor cell expressed, developmentally down-regulated9)属于接头分子CAS家族中的一员，是一种骨架蛋白，定位于黏着斑，它在介导细胞信号转导中发挥重要作用，能通过调节蛋白复合体调控细胞的粘附、迁移和侵袭、趋化作用、凋亡/失巢凋亡和细胞周期等诸多生物学行为。现有证据表明，NEDD9是恶性肿瘤的促转移基因，其高表达与多种恶性肿瘤的不良预后相关，如黑色素瘤、乳腺癌和头颈部鳞癌等。已有国外研究小组通过基因芯片筛选出NEDD9是晚期浆液性卵巢癌与早期浆液性卵巢癌差异表达的基因，但未进一步验证。NEDD9蛋白在卵巢癌中的表达及作用目前尚无从得知。因此，本课题将通过以下三部分的研究初步探讨NEDD9在EOC中的表达和临床意义，及其在EOC恶性生物学行为中的作用及机制，以期为早期诊断和基因靶向治疗EOC提供新的靶点。第一部分 NEDD9在上皮性卵巢癌中的表达及临床意义目的：检测NEDD9在EOC组织和细胞中的表达，并分析NEDD9的表达水平与EOC患者临床病理特征和预后的关系。方法：（1）采用免疫组化法检测NEDD9蛋白在129例EOC、18例卵巢交界性囊腺瘤、22例卵巢良性囊腺瘤及15例正常卵巢组织石蜡标本中的表达，并分析NEDD9蛋白表达水平与EOC患者临床病理特征的相关性。（2）采用Western blotting法检测NEDD9蛋白在28例EOC、10例卵巢交界性囊腺瘤、14例卵巢良性囊腺瘤及10例正常卵巢组织新鲜冰冻标本中的表达。（3）采用Kaplan-Meier法分析NEDD9蛋白表达水平对EOC患者生存时间的影响，并采用COX回归分析探讨影响EOC患者生存时间的因素。（4）采用Western blotting检测NEDD9蛋白在不同EOC细胞株（SKOV3、OVCAR-3、3AO、A2780）中的表达，并采用免疫荧光法分析NEDD9蛋白在EOC细胞中的定位。结果：（1）免疫组化结果显示，NEDD9在129例EOC组织中广泛表达（高表达：69.0%，低表达：31.0%）；而在正常卵巢组织、卵巢良性囊腺瘤组织及卵巢交界性囊腺瘤组织中表达很低甚至不表达，其阳性表达率依次为：6.7%，13.6%，16.7%，与EOC相比，差异均有统计学意义（P0.01）。在EOC组织中，NEDD9蛋白在FIGO III/IV期组织中的表达高于在FIGOⅠ/Ⅱ期组织中的表达（P＜0.001）、在中低分化肿瘤组织（G2/G3级）中的表达高于在高分化肿瘤组织（G1级）中的表达（P＜0.001）、在术后残余肿瘤直径≥1cm组织中的表达高于在术后残余肿瘤直径＜1cm组织中的表达（P=0.028），但其表达水平与EOC患者诊断时的年龄，血清CA125水平，腹水量及病理类型无关（P＞0.05）。（2）Western blotting结果显示，NEDD9蛋白在EOC组织中的表达（1.46±0.26）明显高于其在正常卵巢（0.52±0.06；P＜0.01）、卵巢良性囊腺瘤（0.52±0.11；P＜0.01）和卵巢交界性囊腺瘤（0.68±0.12；P＜0.01）组织中的表达。（3）Kaplan-Meier分析结果显示， NEDD9蛋白高表达的EOC患者的总生存期/疾病无进展生存期明显短于NEDD9蛋白低表达的EOC患者（P＜0.001），多因素COX回归分析表明：NEDD9蛋白高表达（HR=2.006，P=0.033）、FIGO分期晚（HR=8.786，P＜0.001）、肿瘤组织分化差（HR=11.210，P=0.01）仍是EOC的独立预后因子。（4）NEDD9在SKOV3，OVCAR-3和3AO三种细胞株中表达较高，而在A2780细胞中表达较低。免疫荧光结果显示，NEDD9蛋白主要表达于细胞的胞浆及胞膜。结论：NEDD9蛋白在EOC组织中高表达，其高表达与EOC患者的FIGO分期晚、肿瘤组织病理分化差、不理想的肿瘤细胞减灭术及患者的不良预后相关，提示NEDD9可能在调控EOC的发生发展中具有重要作用。NEDD9在EOC细胞株中的表达不同，可能与细胞的侵袭转移能力相关。第二部分 NEDD9shRNA慢病毒载体的构建及稳定转染SKOV3细胞的筛选目的：构建靶向沉默NEDD9基因的慢病毒载体，并建立稳定转染NEDD9shRNA慢病毒的SKOV3细胞株，为进一步的细胞功能学研究奠定基础。方法：（1）设计并合成四条靶向沉默NEDD9shRNA序列（NEDD9shRNA-1，-2，-3，4）和一条阴性对照序列，连接入线性化的慢病毒载体，PCR筛选阳性克隆，，DNA对阳性克隆进行测序鉴定。（2）将测序鉴定正确的重组质粒与Lipofectamine2000共转染293T细胞后，收获上清并浓缩、测定滴度。（3）按MOI=40转染SKOV3细胞，转染72h后收获细胞，采用Real-time PCR法检测NEDD9mRNA的表达，初步筛选干扰效果最佳的靶点。（4）利用干扰效果最佳的靶点慢病毒建立稳定转染的SKOV3细胞，并采用Real-time PCR和Western blotting分析稳定转染后SKOV3细胞中NEDD9mRNA和蛋白的表达。结果：（1）设计并成功合成四条NEDD9shRNA干扰序列和一条阴性对照序列。DNA测序鉴定表明成功构建了NEDD9shRNA慢病毒重组质粒。（2）慢病毒转染SKOV3细胞72h后的PCR结果显示，NEDD9sh RNA-4靶点干扰效果最佳。（3）利用嘌呤霉素成功筛选出稳定转染NEDD9shRNA-4慢病毒载体的SKOV3细胞株，并且Real-time PCR和Westernblotting分析结果显示NEDD9mRNA和蛋白的表达均明显被抑制。结论：成功构建并筛选出高效靶向干扰NEDD9基因的慢病毒表达载体（NEDD9shRNA-4），并成功建立稳定转染的卵巢癌 SKOV3细胞株，为进一步研究NEDD9调控卵巢癌SKOV3细胞恶性行为的作用及机制奠定基础。第三部分 NEDD9shRNA对卵巢癌SKOV3细胞恶性生物学行为的影响及机制初步探讨目的：观察NEDD9基因沉默对卵巢癌SKOV3细胞恶性行为的影响，初步探讨NEDD9参与卵巢癌发生发展的分子机制。方法：将NEDD9基因沉默前后的SKOV3细胞分为三组，即未转染的SKOV3细胞为SKOV3-CON组；稳定转染无关序列的SKOV3细胞为SKOV3-NC组；稳定转染沉默NEDD9基因的SKOV3细胞为SKOV3-KD组。（1）采用粘附实验观察NEDD9基因沉默前后SKOV3细胞粘附能力的变化。（2）采用Transwell迁移和侵袭实验观察NEDD9基因沉默前后SKOV3细胞迁移和侵袭能力的变化。（3）采用MTT实验和平板克隆实验观察基因沉默前后SKOV3细胞克隆增殖能力的变化。（4）采用Western blotting法检测NEDD9基因沉默前后SKOV3细胞中E-cadherin、MMPs及ERK1/2和p38MAPK信号通路相关蛋白表达的变化。结果：（1）粘附实验结果显示，NEDD9基因沉默使SKOV3细胞的同质粘附能力增强，异质粘附能力减弱。（2）NEDD9基因沉默抑制卵巢癌SKOV3细胞的体外迁移和侵袭能力：Transwell迁移实验结果显示，与SKOV3-CON组和SKOV3-NC组相比，SKOV3-KD组的穿过聚碳酸脂膜的迁移细胞数明显减少（P＜0.05）。Transwell侵袭实验结果显示，与SKOV3-CON组和SKOV3-NC组相比，SKOV3-KD组穿过Matrigel基质胶的侵袭细胞数明显减少（P＜0.05）。（3）NEDD9基因沉默降低卵巢癌SKOV3细胞的体外增殖能力：MTT实验结果显示，观察培养0-7d后，与SKOV3-CON组和SKOV3-NC组相比，SKOV3-KD组细胞生长曲线相对平缓，细胞生长增殖明显收到抑制（P＜0.05）平板克隆实验结果显示，与SKOV3-CON组和SKOV3-NC组相比，SKOV3-KD组细胞的克隆形成数目明显减少（P＜0.05）。（4）Western blotting结果显示，NEDD9基因沉默后，SKOV3细胞中E-caherin表达增加，MT1-MMP、MMP-2和P-ERK1/2表达减少，而MMP-9和p38MAPK信号通路相关蛋白的表达则无变化。结论：NEDD9基因沉默增强了卵巢癌SKOV3细胞的同质粘附能力，降低了异质粘附能力，抑制了细胞的增殖和侵袭转移能力；NEDD9可能通过调控ERK1/2信号通路的活性介导EOC的恶性生物学行为。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.31

【参考文献】