颗粒细胞骨形态发生蛋白-9评估IVF卵母细胞成熟及胚胎发育

发布时间：2018-03-09 06:25

本文选题：骨形态发生蛋白-9　切入点：体外受精-胚胎移植　出处：《河北医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:在体外受精-胚胎移植(In vitro ferti1ization-embryo transfer,IVF-ET,IVF)过程中,能够准确判断卵母细胞成熟度对于受精、胚胎发育、妊娠的建立以及胎儿发育具有深刻的影响。提高卵母细胞成熟度对改善IVF妊娠结局具有重大意义。骨形态发生蛋白-9(Bone morphogenetic protein-9,BMP-9)是骨形态发生蛋白家族(Bone morphogenetic protein,BMP)中的一种,大量存在于肝脏,具有诱导和维持胚胎神经元的类胆碱分化、调节葡萄糖和脂肪酸代谢、调节体内铁的动态平衡等多种重要功能,是目前已知的BMPs中诱导成骨能力最强的因子。近期有研究发现BMP-9在大鼠原始颗粒细胞对类固醇生成存在作用,因此我们推测BMP-9可能存在人卵巢颗粒细胞中并参与生殖系统的调节。本研究检测IVF-ET助孕患者颗粒细胞中BMP-9水平,分析其与年龄、体重指数(Body mass index,BMI)、受精率、优质胚胎率,卵子利用率之间的关系,探讨BMP-9对卵子质量、受精及胚胎发育的影响。方法:选取2015年4月至2015年7月于河北医科大学第四医院生殖医学科接受常规IVF-ET,采用长方案控制性促排卵治疗的患者作为研究对象,共85例。年龄20-38周岁;窦卵泡数≥7个;月经周期规律。采用免疫细胞化学法检测BMP-9在颗粒细胞中的表达定位,逆转录PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测颗粒细胞中BMP-9 m RNA和蛋白的表达水平。控制性促排卵治疗:患者均采用长方案治疗,于黄体期中期开始用药,皮下注射促性腺激素释放激素激动剂(Gonadotrophin releasing hormone agonist,Gn RHa)1.4mg,第14天测定血清卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone,FSH)、黄体生成素(Luteinizing hormone,LH)、雌二醇(Estradiol,E2)水平,并B超下监测卵泡大小及子宫内膜(Endometrium,EM)厚度,达到降调节水平(LH≤2.5IU/L,FSH≤3IU/L,E2≤30pg/ml,EM≤5mm),后给予重组人促卵泡激素注射液(r-FSH)150-225IU促排卵,超声监测子宫内膜及卵泡生长情况,必要时抽取肘静脉血监测LH、E2、孕激素(Progesterone,P)水平,当有2个卵泡直径大于20mm,且血清E2水平为每个卵泡约200-300pg/ml时,当晚注射艾泽250μg(重组人绒促性素注射液,意大利)。36-37h后经阴道超声指导下取卵。卵母细胞及胚胎评价:评估卵子颗粒细胞复合体采用MⅡ卵评分系统。受精后16~20小时采用SCOTT合子评分标准,观察受精卵的原核形态。受精卵继续培养48小时,采用卵裂期胚胎评分标准进行评分,检查胚胎发育情况。颗粒细胞采集:留取全部卵泡液,收集细胞沉淀。50%的Percoll细胞分离液分离颗粒细胞,红细胞裂解液裂解残留的红细胞,PBS洗涤后离心,下层即为颗粒细胞。部分颗粒细胞加入2ml Trizol液完全裂解后置于-80℃冻存,用于RT-PCR实验;部分-80℃直接冻存,用于Western blot实验;另留取少量颗粒细胞涂片,4%多聚甲醛固定后用于免疫细胞化学实验。免疫细胞化学法:对颗粒细胞进行固定及透化处理;封闭内源性过氧化物酶及非特异性结合位点。一抗采用兔抗人多克隆BMP-9抗体(山羊血清按照1:200)(ABCAM),阴性对照以PBS代替一抗,并按照免疫细胞化学法进行检测。Leica显微照相系统进行图像懫集。RT-PCR技术:Trizol法提取颗粒细胞中的总RNA,反转录采用PROMEGA试剂盒,按照说明书进行。以β-actin为内参,将目的基因扩增。产物于20g/L的琼脂糖凝胶电泳,目的基因与内参扩增产物电泳条带亮度密度比值为BMP-9 m RNA的相对表达量。Western Blot:细胞裂解液裂解颗粒细胞;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳;分离蛋白条带,转移至PVDF膜上;5%脱脂奶粉封闭1小时;将PVDF膜放入BMP-9抗体工作液(1∶1 000)中,4℃过夜;TBST洗膜三次;加二抗孵育1小时,用TBST液洗膜三次。β-actin为内参。用双色红外激光扫描器进行扫描,记录灰度值,目的条带与内参照的光密度比值为BMP-9蛋白的相对表达量。统计分析:所有数据采用SPSS13.0统计软件进行统计分析。计量资料采用`x±s表示,组间差异采用t检验,P0.05即有显著性差异。对相关的计量资料采用Person相关系数进行相关性分析。结果:1 BMP-9定位表达于人颗粒细胞胞浆,个体间表达水平有差异(图1)。2颗粒细胞中BMP-9m RNA的表达2.1颗粒细胞中BMP-9m RNA的表达同患者的年龄、BMI、b FSH、b LH、GN总量、GN天数均无直线相关关系(表1)。2.2颗粒细胞中BMP-9m RNA表达同患者的获卵数、受精数、MⅡ卵数、2PN数、受精率、优质胚胎率、卵子利用率均无直线相关关系(表2)。3颗粒细胞中BMP-9蛋白的表达3.1颗粒细胞中BMP-9蛋白的表达个体水平间存在差异(图2)。3.2颗粒细胞中BMP-9蛋白的表达同患者的年龄、BMI、b FSH、b LH、GN总量、GN天数均无直线相关关系(表1)。3.3颗粒细胞中BMP-9蛋白表达同患者的获卵数、MⅡ卵数、受精数、2PN数、受精率、优质胚胎率、卵子利用率均无直线相关关系(表2)。4颗粒细胞中BMP-9 m RNA表达同蛋白表达的相关系数为0.220,P=0.043,存在相关关系(图3)。5根据BMP-9 m RNA的相对表达量(0.155-0.690),选取均数0.403为节点,分为低表达组(n=41)和高表达组(n=44)(图4),两组间基础资料无统计学差别(表3)。BMP-9m RNA高表达组优质胚胎率、卵子利用率高于低表达组,有统计学差别(P0.05)(表4)。结论:1 BMP-9 m RNA及蛋白在人类卵巢颗粒细胞中均有表达。BMP-9蛋白表达于颗粒细胞胞浆中,可能作为自分泌/旁分泌因子参与生殖系统调控。2 BMP-9 m RNA同蛋白质的表达具有直线相关关系。3 BMP-9高表达可提高优质胚胎率,改善卵母细胞质量,说明BMP-9或可成为评估卵子质量的指标之一。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R714.8

【参考文献】