DNA甲基化检测在宫颈癌筛查中的应用

发布时间：2018-03-11 00:02

  本文选题：宫颈癌　切入点：肿瘤抑制基因　出处：《山东大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率在女性肿瘤中均居第四位；在女性生殖系统肿瘤中仅次于乳腺癌,居第二位。世界卫生组织(World Health Organization, WHO)下属的国际癌症研究机构(International Cancer Research Institute, IRAC)公布的2012年全球肿瘤流行病统计数据显示,宫颈癌每年的新发病例约为528,000例,死亡病例约为266,000例。宫颈癌的发病率在不同国家之间差距较大,约有70%的新发病例集中在发展中国家；其中,中国新发病例的比例约占11.7%,死亡病例约占11.1%。中国国家癌症中心发布了2015年中国癌症预计发病及死亡情况。宫颈癌的新发病例和死亡病例预计约为98,900例和30,500例,且其发病趋势及死亡趋势均与发达国家相反,呈现明显的上升趋势。甚至有数据显示,到2030年,宫颈癌的年致死病例将达到474,000例,约有95%发生在中低收入国家,之所以造成如此显著差异的主要原因是欠发达地区缺乏有效的筛查和早诊早治措施。因此,在中国寻找宫颈癌筛查的有效方法,筛查出宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)以及肿瘤患者,实施有效的早期干预措施具有重要意义。目前应用最广泛的宫颈癌筛查方法为宫颈液基细胞学检查和高危型HPV检测。然而,这两种方法均存在自身的局限性,影响了筛查的效果。液基细胞学检查的局限性表现在：(1)敏感性较低,一项覆盖欧洲和北美6万余人次的数据显示,细胞学检查在初筛过程中遗漏了约有一半的CIN2、CIN3及宫颈癌(CIN2+)患者,常造成对患者的漏诊漏治；(2)细胞学涂片的取材、制片、阅片水平参差不齐,缺乏规范化的质量控制,主观依赖性强。高危型HPV检测的局限性表现在：(1)高危型HPV的终生感染风险为80%,HPV检测虽能提高灵敏度,但无法区分一过性HPV感染和致病性持续感染；(2)育龄期妇女,尤其是年龄小于30岁的女性HPV的感染率高,临床提示意义较弱。单一依赖HPV筛查,其较低的特异性易造成有限的社会、医疗资源的浪费及对患者的过诊过治。综上所述,在宫颈癌筛查的临床实践过程中,寻找不依托于传统的形态学观察、诊断效能高且简便易行的分子生物学筛查标记物迫在眉睫。DNA甲基化,即未甲基化胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(Cytosine-phosphate-Guanosine, CpG)二核苷酸发生甲基化。甲基化是一种重要的表观遗传修饰机制,肿瘤组织中存在着基因组普遍的低甲基化和局部区域的过甲基化现象。肿瘤抑制基因发生杂合性丢失(loss of heterozygosity, LOH)、基因突变、异常甲基化等变化导致正常功能丧失时,细胞的增殖失控形成恶性肿瘤。DNA甲基化是肿瘤抑制基因功能失活和转录抑制的关键机制之一,且在某些情况下可能是唯一的机制。肿瘤抑制基因启动子的过甲基化,在包括宫颈癌在内的许多肿瘤的发生、发展的各个阶段,均有其特异性的改变模式；在进展的过程中,由于启动子的过甲基化,引起了不同肿瘤抑制基因的失活。表观遗传学改变的累加效应在宫颈由正常组织—癌前病变—宫颈癌的发展过程中有着重要的意义。因此,作为癌症发生的早期事件,DNA甲基化检测可以在宫颈癌前病变阶段做出分子学诊断,分流出亟需临床干预措施的人群,为宫颈癌的筛查和早诊早治提供新的方法。国内外研究者利用肿瘤抑制基因的甲基化检测,已经在很多肿瘤的筛查研究中取得了巨大的进展。在宫颈癌筛查的应用中,一些肿瘤抑制基因的甲基化检测呈现潜在的临床应用价值。但是仍存在一些问题,如：(1)诊断效能欠佳：与高危HPV相比,一些甲基化分子标记物的敏感性显著下降；稳定性差、呈现较强的异质性,即使同一基因在不同研究之间也存在较大差异；(2)多数研究在临床应用方面未进行深入、详尽的探讨,一些临床应用的热点未有涉及；临床样本量较小,代表性较差。本课题将分两部分进行研究和探讨：第一部分 宫颈癌筛查的甲基化分子标记物的筛选和验证背景和目的宫颈癌是一种常见的妇科肿瘤,严重危害妇女健康。DNA异常甲基化作为癌症发生的早期事件,在从正常宫颈—癌前病变—癌的发展过程中呈现出阶段特异性及累加性。本研究通过分析多个甲基化分子标记物的甲基化水平与病变严重程度之间的关系,以筛选出高级别病变特异性的甲基化分子标记物。材料和方法1.结合文献及The Cancer Genome Atlas (TCGA)数据库分析,筛选出宫颈癌特异性的过甲基化肿瘤抑制基因,针对同一基因的多个位点进行引物设计。2.应用甲基化特异性PCR (Methylmion Specific PCR, MSP)在43例宫颈癌组织及27例正常对照的宫颈组织中初步筛选出差异显著的甲基化位点。3.应用实时定量甲基化PCR (QMSP):(1)在训练集(train set)—267例有明确病理检查结果的宫颈脱落细胞标本中,对初步筛选出的差异显著的甲基化位点进行验证及进一步筛选。(2)将进一步筛选出的甲基化位点,经测试集(test set)—224例有明确病理检查结果的宫颈脱落细胞标本验证,分析其与训练集相关数据的一致性。(3)应用焦磷酸测序的方法对进一步筛选出的特异性甲基化位点进行验证及分析。结果1.综合分析筛选出甲基化异常基因CCNA1、CADM1、DAPK1、JAM3,设计多个位点的引物。经引物特异性验证后,选定4个基因的共27个位点进行MSP检测。2.MSP检测初步筛选出在宫颈癌组织和正常宫颈组织中甲基化程度差异最显著的5个位点。这5个位点分别为(CADM1-M2、CADM1-M8、DAPK1-M2、 DAPK1-M3及JAM3-M4,其在宫颈癌组织中的甲基化阳性率分别为65.1%(28/43)、74.4%(32/43)、69.8%(30/43)、76.7%(33/43)及86.0%(37/43)；在正常组织中的甲基化阳性率分别为22.2%(6/27)、0.0%(0/27)、11.1%(3/27)、7.4%(2/27)及7.4%(2/27),5个位点组间差异的P值均0.001。3.临床实践中的筛查界值一般为高级别病变。当界值分别为CIN2和CIN3时,其对应的诊断分类为CIN2+/CIN1-(CIN1和正常对照)及CIN3+(CIN3和癌)／CIN2-(CIN2, CIN1和正常对照)。鉴于CIN2的异质性,本研究还对诊断分类CIN3+/CIN1-进行了分析。在训练集中,经QMSP的验证和进一步筛选,提示：(1)分析基因位点的甲基化水平与宫颈病变严重程度的相关性：①除DAPK1-M3外,CADM1-M2、CADM1-M8、DAPK1-M2、JAM3-M4等4个位点在CIN1-和CIN3+两组间均存在显著差异；②DAPK1-M2、DAPK1-M3、JAM3-M4等3个位点在CINl-和CIN2两组间存在显著差异③JAM3-M4在CIN1-、CIN2及CIN3+中的任两组间都存在显著差异。(2)应用logistic回归分析基因甲基化位点单独或联合的诊断效能：①对于CIN3+/CIN1-和CIN3+/CIN2-诊断分类,单独应用JAM3-M4即可得到最优诊断效能；②对于CIN2+/CIN1-诊断分类,CADM1-M8(P=0.001)、DAPK1-M3 (P=0.038)和JAM3-M4 (P=0.011)联合的诊断效能最优,但是3个基因联合的受试者工作特征曲线下面积(the area under the receiver operating characteristic curve, AUC)为0.806,只略高于单独应用JAM3-M4的AUC (AUC=0.793)。基于此,为了统一各个诊断分类,我们在后续的分析及验证中选取了JAM3-M4位点。在测试集中,经QMSP验证,提示：对于训练集中的CIN3+/CIN1-、CN3+/CIN2-及CIN2+/CIN1-诊断分类,JAM3-M4的AUC分别为0.907、0.860和0.793。对于测试集的CIN3+/CIN1-、CIN3+/CIN2-及CIN2+/CIN1-诊断分类,JAM3-M4的AUC分别为0.900、0.870和0.765；其诊断效能在训练集和测试集中呈现较高的一致性。4.经焦磷酸测序验证,JAM3-M4的甲基化率在CIN1-、CIN2及CIN3+中的任两组间都存在显著差异。结论JAM3-M4的甲基化水平随宫颈病变程度的加重逐渐升高。对于CIN3+/cIN1-、 CIN3+/CIN2-及CIN2+/CIN1-诊断分类,JAM3-M4在各组间均呈现较一致的、较稳定的显著差异,提示其可成为宫颈高级别病变的分子生物学标记物,在宫颈癌的筛查中有潜在的应用价值。第二部分甲基化分子标记物JAM3-M4在宫颈癌筛查中的应用背景和目的宫颈癌作为一个病因相对明确的肿瘤,是WHO唯一建议在世界范围内开展筛查的恶性肿瘤。从HPV感染到宫颈癌一般需要10到20年,这为临床上宫颈癌的筛查以及在癌前病变阶段实行有效的干预措施提供了可能。目前应用最广泛的宫颈癌筛查方法为宫颈液基细胞学检查和高危型HPV检测。基于第一部分的研究,JAM3-M4在宫颈癌的筛查中有潜在的应用价值。我们接下来将JAM3-M4与常用筛查方法进行比较,并分析其在单独应用、联合应用及分流应用等方面的价值；另外,分析其对异质性CIN2的分流作用。材料和方法1.收集患者的临床资料,包括患者基本信息、临床上常用筛查方法(宫颈液基细胞学检查及高危HPV检测)的结果；比较常用筛查方法与JAM3-M4的诊断效能。2.在训练集患者中,利用ROC曲线分析JAM3-M4在各种临床应用中的诊断效能(AUC、敏感性、特异性、阳性预测值及阴性预测值)；结合临床实践,研究及探索诊断效能较高、应用意义较大的JAM3-M4筛查方案。另外,进一步在测试集的患者中验证其诊断效能的一致性。3.对CIN2的活检病理切片进行免疫组化P16染色,结合CIN2的JAM3-M4的甲基化状态,探讨两者的相关性及JAM3-M4分流CIN2的可行性。结果1.与细胞学检查和高危HPV检测相比,在CIN3+/CIN1-、CIN3+/Cin2-及CIN2+/CIN1-诊断分类中,JAM3-M4能显著提高诊断的特异性、阳性预测值。2.在临床实践中,JAM3-M4的以下应用有较好前景：(1)分流作用：①分流高危HPV检测阳性的患者时,与细胞学检查相比,JAM3-M4在CIN3+/CIN1-、CIN3+/CIN2-及CIN2+/CIN1-诊断分类中均能显著提高诊断的特异性、阳性预测值；阴性预测值也有一定升高；②分流细胞学检查结果为ASCUS和LSIL的患者时,与高危HPV检测相比,JAM3-M4在CIN3+/CIN1-、 CIN3+/CIN2-及CIN2+/cin1-诊断分类中均能显著提高诊断的特异性、阳性预测值；③经验证,在训练集及测试集中,.JAM3-M4分流高危HPV阳性及细胞学结果为ASCUS和LSIL的患者时,诊断效能的一致性较好；④对于19例年龄为30岁以下的ASCUS患者,高危HPV均为阳性；其中15例经病理诊断为CIN1-,这些患者的JAM3-M4均为阴性。(2)联合作用：①与细胞学检查和高危HPV检测联用相比,JAM3-M4和细胞学检查联用在CN3+/CIN1-、CIN3+/CIN2-及CIN2+/CIN1-诊断分类中均能显著提高诊断的特异性、阳性预测值；②经验证,JAM3-M4在训练集及测试集中,与细胞学检查联用的诊断效能一致性较好。3.CIN2中,免疫组化P16染色的阳性率为69.9%,JAM3-M4的阳性率为48.8%,两者的相符率为60.5%。结论与常用的筛查方法相比,JAM3-M4能显著提高诊断效能,在宫颈癌早期筛查中有潜在的应用价值。1.JAM3-M4可用于分流高危HPV检测阳性及细胞学检查结果为ASCUS尤其是年龄小于30岁的患者)、LSIL的患者。2. JAM3-M4与细胞学检查联合应用可提高诊断效能。3.对于临床上争议较大的异质性强的CIN2, JAM3-M4有一定的分流效能。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.33
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本文编号：1595659