S100A6对宫颈癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响及其机制研究

发布时间：2018-03-16 21:57

本文选题：S100A6　切入点：宫颈癌　出处：《重庆医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景和目的宫颈癌是全球第二大常见的妇科癌症,是女性癌症相关死亡的主要原因之一。细胞学筛查的普及和疫苗的应用使宫颈癌在早期诊断和预防方面取得了长足的进步,但其转移和复发仍然是其主要的死亡原因。因此,进一步阐释其发生发展机制和探寻治疗新靶标对宫颈癌的预防和治疗具有积极意义。S100A6是S100家族成员之一,参与多种生物学作用。近年来,S100A6在肿瘤中的作用成为研究热点。已有研究表明,它在人结直肠癌、胃癌、肝癌和骨肉瘤等多种肿瘤的进程中具有重要作用。在宫颈鳞癌组织中,该蛋白的表达明显升高,并与病变恶性程度和淋巴结转移成正相关。但是,S100A6对宫颈癌细胞增殖、迁移的明确作用尚无报道。因此,本课题以宫颈癌细胞为研究对象,探讨S100A6对其增殖、凋亡和迁移的影响及其机制,为阐明宫颈癌进展机制积累实验依据,为该病的诊断及治疗提供新的靶标及理论依据。方法1.宫颈癌细胞系中S100A6的内源性表达用定量多聚酶链反应(q PCR)测定宫颈癌细胞系中S100A6的内源性表达。2.制备S100A6表达的干预工具及其效果验证(1)重组腺病毒的扩增和干预效果验证通过将分别携带人S100A6基因及其干扰RNA的编码序列的重组腺病毒Ad S100A6和Adsi S100A6及各自对照Ad GFP和Ad RFP感染人胚肾细胞HEK293进行扩增;再将这些重组腺病毒分别感染宫颈癌细胞后提取总蛋白,Western Blot验证这些病毒的感染对S100A6基因表达的干预效果。(2)重组蛋白GST-S100A6的制备与鉴定将重组质粒p GST-moluc-S100A6转化至E.coli BL21感受态中,于LB培养基中培养,用IPTG诱导该融合蛋白表达;培养6-8 h后,收集菌液;超声破菌;再用GS 4B球珠分离纯化其中的该重组蛋白;采用SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色、Western Blot对制备的GST-S100A6进行鉴定。3.S100A6对宫颈癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响通过MTT法和Hoechst染色法分别检测S100A6对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响;采用划痕愈合试验和Transwell试验检测S100A6对其迁移的作用。4.S100A6促宫颈癌细胞增殖、迁移的机制研究(1)Western Blot检测S100A6处理后PI3K/Akt信号通路相关分子蛋白水平的改变,PCR检测β-catenin下游靶基因m RNA水平的改变。(2)Western Blot检测S100A6和PI3K抑制剂LY294002共同处理后PI3K/Akt信号通路的变化。MTT法和Transwell Assay检测S100A6和LY294002共同处理后细胞增殖、迁移的变化。(3)PCR和Western Blot检测S100A6对宫颈癌细胞EMT的影响。结果1.S100A6在He La细胞中低水平表达,而在Si Ha和Ca Ski细胞中的表达水平则相对更高,分别是He La细胞S100A6水平的6.92倍和7.54倍。2.经Western Blot检测发现,Ad S100A6可以明显增加被感染的宫颈癌细胞内S100A6的水平,Adsi S100A6可以明显减少S100A6的水平。提示:扩增的这两种重组腺病毒感染能够有效干预该基因的表达。经SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色发现,该重组蛋白的相对分子质量约为36 k D,符合我们对GST-S100A6分子量的预期;同时,该重组蛋白可以被S100A6单克隆抗体特异性识别(Western Blot)。提示:制备的重组蛋白是GST-S100A6。3.S100A6对宫颈癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响(1)Ad S100A6感染后的He La和Ca Ski细胞的增殖能力明显增强,其72 h时的OD492值分别是各自对照组的1.2倍(P0.01)和1.3倍(P0.005),而Adsi S100A6感染的Si Ha和Ca Ski细胞的增殖能力则明显降低,其72 h时的OD492值仅为各自对照组的81.9%和81.3%(P0.05)。提示S100A6具有促宫颈癌细胞增殖的作用。(2)与各自对照相比,经Ad S100A6上调S100A6表达的He La和Ca Ski细胞的凋亡数目无明显变化;经Adsi S100A6下调S100A6表达后的Si Ha和Ca Ski细胞的凋亡数也无明显变化。提示S100A6对宫颈癌细胞的凋亡无明显影响。(3)Ad S100A6处理72 h的He La细胞的划痕愈合率是Ad GFP处理组的2.1倍(P0.05);Ad S100A6处理72 h的Ca Ski细胞的划痕愈合率是Ad GFP处理组的3.6倍(P0.01)。与之一致的是,Adsi S100A6处理后细胞的划痕愈合率则明显降低,Si Ha细胞和Ca Ski细胞72 h的划痕愈合率分别是各自对照组(Ad RFP处理)的59%和56%(P0.05)。提示,S100A6可以促进宫颈癌细胞迁移。Ad S100A6感染72 h的He La细胞组的穿膜细胞数是Ad GFP组的5倍(P0.005);Ad S100A6感染72 h的Ca Ski细胞组的穿膜细胞数是Ad GFP组的2倍(P0.01);Adsi S100A6处理72 h的Si Ha细胞和Ca Ski细胞组的穿膜细胞数则分别只有各自Ad RFP组的34%(P0.005)和35%(P0.01)。该结果与划痕试验结果一致地提示S100A6可促进宫颈癌细胞迁移。4.S100A6促宫颈癌细胞增殖、迁移的机制探讨(1)S100A6可激活宫颈癌细胞中的PI3K/Akt信号通路。与对照组相比,Ad S100A6组p-Akt、p-GSK3β和β-catenin的蛋白水平明显上升,c-myc、MMP7和cyclin D1的m RNA水平也明显上升。(2)S100A6促进宫颈癌细胞增殖和迁移的作用与PI3K/Akt信号通路的激活有关。(1)LY294002可以明显降低He La细胞的p-Akt水平,其最适浓度为10μM;(2)LY294002处理对S100A6上调p-Akt,p-GSK3β和β-catenin的活性具有抑制作用;(3)LY294002处理可以明显抑制S100A6增强的He La细胞的增殖能力,其48 h时的OD492值是对照组的60%(P0.05),72 h时的OD492值是对照组的49.9%(P0.005);(4)LY294002处理可以明显抑制S100A6增强的He La细胞的迁移能力,其72 h时的穿膜细胞数为对照组的57.14%(P0.005)。(3)S100A6可促进宫颈癌细胞的EMT:与对照组相比,Ad S100A6可以明显上调He La细胞中N-cadherin的蛋白水平和vimentin、Snail、Twist的m RNA水平,而Adsi S100A6可以明显上调Si Ha细胞中E-cadherin的蛋白水平及下调N-cadherin的蛋白水平和vimentin、Snail、Twist的m RNA水平。结论S100A6促进宫颈癌细胞增殖、迁移和EMT;其促进宫颈癌细胞增殖和迁移的效应与PI3K/Akt信号通路的激活有关。即S100A6参与促进宫颈癌的恶性进展,是其诊断及治疗的潜在靶点。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.33

【参考文献】