MDH2通过抑制PTEN发挥促进子宫内膜癌增殖和侵袭作用的初步研究

发布时间：2018-03-19 06:06

本文选题：MDH2　切入点：PTEN　出处：《南京医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：子宫内膜癌是威胁妇女健康的三大生殖道肿瘤之一。在北美和北欧,子宫内膜癌是最常见的女性生殖道恶性肿瘤,占每年新发肿瘤病例的6%,肿瘤死亡病例的3%。子宫内膜癌的发病率呈现明显的地域性,发病率最高的是北美和北欧,其次为东欧和拉丁美洲,发病率最低的是亚洲和非洲。早期子宫内膜癌总体生存率在74-91%,而晚期仅为20-26%。按照临床表现,病理学特征及预后等,子宫内膜癌可以分为两类,Ⅰ型子宫内膜癌通常以内膜样腺癌为主,由内膜增生发展而来,常发生于生育年龄及绝经后妇女,被认为与无拮抗的雌激素暴露相关,Ⅰ型内膜癌预后较好;Ⅱ型子宫内膜癌以浆液性癌或透明细胞癌为代表,通常由萎缩内膜发展而来,多发生于绝经后妇女,是非雌激素依赖型,预后差。雌激素在子宫内膜癌的发病机制中扮演着重要角色。无拮抗的雌激素暴露被公认为是Ⅰ型子宫内膜癌的重要风险因素。大样本研究也已证实,无论Ⅰ型还是Ⅱ型子宫内膜癌,肿瘤组织中雌激素含量都高于正常组织。经典的雌激素代谢理论认为,雌激素通过与细胞核的雌激素受体ER结合激活转录因子和下游信号通路发挥生理学效应,这个过程通常需要数小时。事实上,雌激素还可以通过与细胞膜上的G蛋白偶联受体GPR30结合启动仅耗时数分钟甚至数秒钟的快速雌激素信号通路。我们之前的研究中已经证实,雌激素可以通过与GPR30的结合激活MAPK途径促进子宫内膜癌细胞的增殖侵袭。分子生物学研究揭示了雌激素在促进子宫内膜癌进展的生物学活动中PTEN,PIK3CA,K-RAS,P53,P16等基因突变或失活以及微卫星不稳定现象等的作用。研究表明,PI3K-AKT-PTEN-mTOR,Wnt-β-catenin等信号通路对子宫内膜癌细胞的生存与增殖,基因的转录与表达起到重要的调节作用。而肿瘤抑制因子PTEN在几乎高达80%的子宫内膜腺癌,近55%的子宫内膜增生过长病例中存在突变或失活。诸多研究数据提示,PTEN基因的突变是子宫内膜癌病变早期的致病因素之一。80多年前,Otto Warburg提出了瓦氏效应,开启了肿瘤代谢研究的新纪元。瓦氏效应指出,即使在氧供充足的情况下,肿瘤细胞仍优先选择糖酵解的方式提供能量。众所周知,有氧氧化可将一分子葡萄糖完全转化为二氧化碳和水,同时产生34分子ATP;而糖酵解途径在生成乳酸的同时,仅产生2分子ATP。肿瘤细胞选择这种产能效率低的代谢方式的现象引起了人们的思考。Warburg认为肿瘤细胞线粒体功能的损伤使其不得不选择糖酵解途径产能。然而,数十年来,越来越多的研究数据显示,大多数肿瘤细胞的线粒体功能并未受损,不仅如此,肿瘤细胞的线粒体中还发生了代谢重编程。在重编程过程中,代谢酶对肿瘤的发生发展起到了重要的作用。它们发挥自身酶的催化作用,或是发生基因突变,亦或通过抑制细胞的死亡途径等提高肿瘤细胞酵解途径的代谢活性,促进肿瘤细胞的增殖侵袭。近年来一些研究显示,部分代谢酶不仅可以发挥酶的催化作用,还可以作为一种转录调节因子直接调控肿瘤抑制基因,从而影响肿瘤细胞的生物学行为。苹果酸脱氢酶是三羧酸循环中的重要代谢酶。MDH催化苹果酸与草酰乙酸的相互转化。事实上,真核生物中,MDH通常有两种亚型,MDH1和MDH2。MDH2参与线粒体TCA循环,而MDH1通常参与苹果酸-天冬氨酸穿梭。MDH在多种肿瘤组织中过表达,如分化较差的消化系统鳞状细胞癌,恶性副神经节瘤,前列腺癌等。MDH在肿瘤组织中表达上调,活性增加,通过提高癌细胞代谢率发挥促进癌细胞的增殖的作用。有趣的是,一项关于MDH1与肿瘤抑制因子p53的关系的研究结果显示,在无葡萄糖的环境下,MDH1通过与下游基因启动子的P53反应元件相互作用反式激活抑癌基因P53的活性。敲除MDH1可显著降低乙酰-p53转录激活组蛋白编码与启动子结合。而且,MDH1还调节p53依赖的细胞周期停滞及凋亡。可见,MDH1可作为一种转录调节因子调控抑癌基因的活动。本实验希望通过科学研究探索苹果酸脱氢酶MDH2与子宫内膜癌抑制因子PTEN之间的关系,以及它们对肿瘤细胞生物学行为的影响,并初步探讨雌激素膜受体GPR30在雌激素对MDH2和PTEN表达调节中的作用,为进一步研究子宫内膜癌的能量代谢机制奠定基础。实验的第一部分,我们采用免疫组织化学法检测子宫内膜癌组织和正常组织MDH2表达情况及表达部位。同时,对临床病理资料进行统计学分析,找出MDH2与子宫内膜癌患者发病年龄,肿瘤的期别,级别,淋巴结转移等生物学特征之间的关系,以揭示MDH2的表达在子宫内膜癌临床病理方面的意义;第二部分,我们采用Realtime-PCR,Western-blot,细胞转染,RNA干扰等方法研究MDH2和PTEN之间的相互影响,并用免疫荧光法直观的展现MDH2与PTEN的表达部位与相互关系。第三部分,采用CCK8,流式细胞学分析,Transwell,凋亡检测,细胞转染,RNA干扰等方法,分别研究MDH2和PTEN对子宫内膜癌细胞增殖,侵袭,转移及凋亡等生物学行为的影响;第四部分,采用Realtime PCR法,研究雌激素,GPR30激动剂和抑制剂对子宫内膜癌细胞增殖的影响。第一部分MDH2在子宫内膜癌组织中的表达及临床病理意义对60孔子宫内膜癌组织芯片进行苏木素染色,结果显示,子宫内膜癌组织中,MDH2呈过表达状态,且其表达部位是细胞质。对这34例子宫内膜癌组织标本的临床病理资料进行的统计学分析显示MDH2的表达与子宫内膜癌的级别相关。这些数据提示MDH2可能在子宫内膜癌的发病机制中发挥了重要作用。第二部分MDH2和PTEN间的相互关系构建RNA干扰质粒MDH2 RNAi敲减MDH2,从细胞水平和蛋白水平均检测到PTEN表达的上升;而过表达质粒GV219-MDH2则会使PTEN的表达水平下降。同样的,用RNA干扰质粒PTENRNAi敲减PTEN,MDH2在细胞水平和蛋白水平的表达都有所上升;而过表达质粒GV219-PTEN则会使MDH2的表达下降。这些结果说明,MDH2和PTEN之间存在相互调节。免疫荧光检测中,我们看到,MDH2和PTEN共同表达与子宫内膜癌细胞HEC-1-A的细胞质中。因此,二者很可能通过直接结合发挥相互调节作用,当然这一猜想还有待实验进一步证实。第三部分MDH2和PTEN对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响构建RNA干扰质粒MDH2 RNAi及过表达质粒GV219-MDH2,并分别转染到子宫内膜癌细胞系HEC-1-A和AN3CA中。结果显示,敲减MDH2抑制了子宫内膜癌细胞的增殖,侵袭和转移,促进了肿瘤细胞的凋亡;而过表达MDH2的子宫内膜癌细胞系AN3CA却表现出增殖,侵袭和转移增强而凋亡减弱的情况。由此可见,MDH2促进子宫内膜癌的增殖侵袭,抑制其凋亡。类似的,我们再分别构建RNA干扰质粒PTEN RNAi和过表达质粒GV219-PTEN并转染内膜癌细胞,结果显示,敲减PTEN后,子宫内膜癌细胞的增殖,侵袭和转移的水平上调,而凋亡却受到抑制;相应的,过表达PTEN后,内膜癌细胞增殖侵袭减弱,凋亡增强。这也再次证实了 PTEN作为肿瘤抑制因子阻碍子宫内膜癌细胞生存侵袭的作用。第四部分雌激素对MDH2和PTEN表达的影响用雌激素,GPR30激动剂G1和抑制剂G15分别刺激子宫内膜癌细胞,在子宫内膜癌细胞系HEC-1-A(ER阳性,GPR30阳性)和AN3CA(ER阴性,GPR30阳性)细胞系中,雌激素和G1刺激MDH2表达上升,而G15使MDH2表达下降。相反,雌激素和G1的刺激使PTEN表达下降而G15使其表达上升。由此,我们不难得出结论,雌激素对MDH2的表达上调及对PTEN的表达下调,很可能是通过GPR30相关的信号通路完成的。综上所述,MDH2很可能在雌激素的刺激下,通过GPR30相关的信号通路抑制PTEN的表达,发挥促进子宫内膜癌细胞的增殖侵袭的作用。MDH2与PTEN相关性的探索为子宫内膜癌代谢机制的研究提供了实验基础。更为深入的实验研究将揭示MDH2在子宫内膜癌发病机制中的作用方式。MDH2很可能成为临床上诊断治疗子宫内膜癌的新的靶点。
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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.33

【参考文献】