去乙酰化酶SIRT3调控卵巢癌细胞代谢增加BH3模拟物S1凋亡敏感性的研究

发布时间：2018-03-23 17:36

本文选题：SIRT3　切入点：BH3模拟物　出处：《吉林大学》2016年博士论文

【摘要】：多种不同类型的癌细胞包括卵巢癌细胞都拥有典型的癌代谢表型,即有“氧糖酵解”,表现为即便在氧气充足的情形下,也更加依赖糖酵解代谢途径产生ATP以供给能量。这一葡萄糖高度依赖的代谢特性,有利于促进癌细胞增殖,促使癌细胞逃避凋亡。在深入探究癌细胞代谢和凋亡相关性的过程中,有研究发现线粒体在受到代谢紧密控制的同时,能够决定在应激过程中细胞的应答方式,最终发生适应性应激反应还是凋亡。值得注意的是,Bcl-2家族蛋白,作为一类重要的细胞凋亡调节因子,已经被证明能够影响线粒体形态及功能。靶向抑制Bcl-2的小分子化合物可通过竞争性结合抗凋亡Bcl-2蛋白,从而诱导多种癌症细胞发生凋亡。新近的研究发现,Bcl-2家族蛋白不仅参与调控癌细胞凋亡,还与癌细胞的代谢过程有关。这些现象表明通过抑制Bcl-2抗凋亡蛋白发挥抗肿瘤作用,可能与癌细胞代谢的改变有关。SIRT3是去乙酰化酶sirtuin家族中定位于线粒体的一个关键酶。通过靶向催化底物蛋白发生去乙酰化,SIRT3参与调控细胞中的多种能量代谢途径,包括呼吸链,三羧酸循环,脂肪酸氧化和酮体生成过程。研究发现SIRT3还同代谢重编程有关,通过促使缺氧诱导因子HIF1-a去稳定性失活,能够控制糖酵解基因的表达。此外,SIRT3还参与了沉默Bcl-2诱导细胞发生凋亡的过程。这些发现提示SIRT3可能成为一个重要的癌症治疗靶点,同时参与调控癌细胞代谢和凋亡过程。本课题组的前期研究发现新型广谱Bcl-2抑制剂S1能够抑制卵巢癌细胞生长,能够诱导细胞发生线粒体途径和内质网应激途径相关的凋亡。本研究以人卵巢癌SKOV3细胞为研究对象,从葡萄糖代谢的角度切入,探究了S1对卵巢癌细胞的损伤作用及其机制。研究发现去乙酰化酶SIRT3活化参与S1诱导的人卵巢癌细胞葡萄糖代谢紊乱过程,可发挥促进细胞死亡的作用。结合S1对癌细胞代谢作用的特点,提出了糖酵解抑制剂与Bcl-2抑制剂联合应用治疗卵巢癌的新方法。方法(1)MTT法检测BH3模拟物S1对卵巢癌细胞SKOV3生存率的影响,卵巢癌移植瘤模型观察S1药物在体对卵巢癌细胞SKOV3生长的影响。(2)S1处理卵巢癌细胞SKOV3,采用Hoechst 33258染色观察细胞核形态;western blot法分析凋亡相关蛋白表达变化。(3)利用对O2和PH敏感的探针检测细胞氧耗率和胞外泌酸率,葡萄糖氧化法和乳酸试剂盒分别测定培养液中葡萄糖和乳酸浓度,利用ATP试剂盒检测细胞内ATP水平。(4)采用PCR array法检测人葡萄糖代谢通路84种相关基因变化,观察S1对代谢各通路的整体影响。(5)采用LC/MS代谢组学技术,检测细胞内代谢物变化,观察S1对细胞代谢的整体影响,以及SIRT3活化对细胞代谢的影响。(6)q PCR法检测SIRT3基因表达变化,Western blot方法检测SIRT3蛋白表达变化,共聚焦免疫荧光技术检测SIRT3与Tom20共定位;分离细胞核蛋白和线粒体蛋白,western blot法检测SIRT3蛋白表达变化。(7)根据SIRT3的基因序列(Gen Bank:NM_012239)以及RNAi设计原理,构建si-SIRT3质粒,并通过western blot法进行验证。si-SIRT3抑制SIRT3表达,MTT法检测细胞生存率;western blot分析细胞内凋亡相关蛋白Caspase3的表达;Caspase3/7荧光素酶试剂盒检测Caspase3/7酶的活性。分离线粒体蛋白,western blot法检测HK-II蛋白表达变化。(8)利用糖酵解抑制剂2-DG进行干预,MTT法检测细胞生存率,western blot法检测Caspase3、SIRT3蛋白的表达。结果(1)MTT检测显示,S1能够剂量依赖性降低卵巢癌细胞SKOV3的存活率;体内移植瘤模型检测显示,S1能够有效抑制卵巢癌细胞体内模型中的生长。(2)S1通过抑制Bcl-2、Mcl-1蛋白表达,诱导SKOV3细胞中细胞色素c释放以及Caspase3活化,S1通过线粒体凋亡途径诱导人卵巢癌细胞死亡。(3)对氧敏感探针和对p H敏感探针检测结果显示,S1能够有效地抑制细胞氧耗率,同时胞外泌酸率有所增加。ATP检测结果显示S1能够降低细胞内ATP水平。(4)PCR array法检测结果显示,在短时间点(6h)人糖代谢信号通路中糖酵解相关基因表达下调,线粒体氧化磷酸化和糖异生通路相关基因表达上调,这表明S1在基因转录水平上对细胞糖代谢基因的表达有调节作用。(5)S1作用后,经代谢组学检测筛得代谢差异物146种,通过联合PCR array基因变化数据进行代谢通路分析,发现人卵巢癌细胞中的三羧酸循环、糖酵解、糖异生以及磷酸戊糖途径受影响最为显著。(6)q PCR和Western blot法检测显示SIRT3基因和蛋白水平表达上调,荧光共聚焦结果显示S1能够引起Tom20发生点状聚集,SIRT3与Tom20共定位水平增加;同时细胞核内SIRT3表达水平下降,提示S1诱导SIRT3亚细胞定位发生了改变,由细胞核转位至线粒体。(7)构建si-SIRT3重组质粒并转染SKOV3细胞,抑制SIRT3表达,能够降低S1对SKOV3细胞的损伤作用,细胞凋亡相关蛋白表达下调,细胞凋亡水平下降。同时,抑制SIRT3能够降低S1对葡萄糖摄入和乳酸分泌的抑制作用。人卵巢癌细胞沉默SIRT3表达,在S1作用下,经代谢组学检测筛选得到代谢差异物137种,发现SIRT3活化主要对人卵巢癌SKOV3细胞中的丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢通路、氮代谢通路、氨酰基转移核糖核酸合成通路等影响最为显著。(8)合用糖酵解抑制剂2-DG和S1,可以降低细胞存活率,同时引起凋亡蛋白和SIRT3蛋白表达上调。结论本研究以人卵巢癌细胞株SKOV3为研究对象,发现S1在体内外研究模型中均能有效抑制卵巢癌细胞的生长。S1能够诱导卵巢癌细胞发生凋亡,同时扰乱细胞糖代谢,主要表型为抑制线粒体有氧呼吸和糖酵解。去乙酰化酶SIRT3活化参与了S1对卵巢癌细胞凋亡的诱导和对细胞葡萄糖代谢的调节,抑制SIRT3可以降低SKOV3细胞中S1诱导的凋亡水平,同时降低S1对SKOV3细胞糖酵解的抑制作用。进一步的研究发现,降低SIRT3的表达能够调节糖酵解关键酶HK-II在线粒体中的表达水平,提示SIRT3可能通过影响HK-II的定位参与调节细胞凋亡和代谢。抑制糖酵解可通过进一步上调SIRT3表达,促进卵巢癌细胞SKOV3中S1诱导的凋亡水平。本文首次从细胞代谢的角度探讨了BH3模拟物S1在卵巢癌细胞中的抗肿瘤作用,SIRT3可能通过调节糖酵解关键酶HK-II在细胞中的定位,参与了S1对卵巢癌细胞凋亡和代谢的调控;SIRT3可能是卵巢癌治疗过程中的新靶点,通过调节人卵巢癌细胞葡萄糖代谢过程,可发挥促进细胞凋亡的作用。结合S1对癌细胞代谢的作用特点,提出了糖酵解抑制剂与Bcl-2抑制剂合加治疗卵巢癌的新方法。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.31

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