血浆hsa-miR-124a-3p RT-qPCR检测方法的建立及在DS产前筛查中的临床应用效能评价

发布时间：2018-03-24 12:29

本文选题：唐氏综合征　切入点：产前筛查　出处：《第三军医大学》2017年硕士论文

【摘要】：唐氏综合征(Down's syndrome,DS)是人类最常见的引起新生儿智力和发育缺陷的先天性遗传疾病,其在出生胎儿的发病率约为1/700。DS患儿除了智力缺陷以外还常常伴有先天性心脏病、精神和体格发育迟滞以及多种器官和组织的畸形等疾病,而且目前尚无有效的治疗手段,因此,做好DS患儿的筛查避免其出生是预防DS的最有效方法。DS的产前检查方案主要分为无创性检查和有创性检查,其中无创性检查主要包括唐氏筛查和无创DNA检测,有创性检查包括羊膜腔液体穿刺检查、绒毛膜穿刺检查和胎儿脐带血检查等。唐氏筛查是目前应用最广泛的DS产前筛查手段,安全性较高,但是特异性较差。无创DNA检测的检查费用较高,且检测周期较长,目前多在第三方的医疗机构应用,不易在基层医疗机构推广。羊膜腔液体穿刺检查、绒毛膜穿刺检查和胎儿脐带血检查均通过侵入性操作获得胎儿细胞并对其进行染色体分型,虽特异性较高,但是受到操作者的临床经验影响大,且有1%导致流产的机率。因此,建立一种安全、价格合理又特异的DS产前检测手段仍旧是产前诊断领域探索的方向,而与胎儿游离DNA(cell free fetal DNA,cff DNA),同属于血液常见分子的微小RNA(micro RNA,miRNA)分子开始引起人们的重视。miRNA是一类长度约为20-25个碱基的非编码RNA小分子,其主要生理作用是调控基因的表达。miRNA可以耐受血液中RNA酶的降解,可以在循环血液中长期稳定的存在,同时miRNA还可以耐受外界强酸、强碱的处理,为miRNA的检测带来了方便。此外,miRNA还具有很强的组织和器官的特异性,为其成为理想的疾病循环血液学标志物奠定了坚实的基础。通过前期研究,我们发现健康胎儿和唐氏患儿孕中期母体血浆存在135种表达差异的miRNA分子,其中,hsa-miR-124a-3p是表达量显著性升高的miRNA分子中差异值最大的分子。因此,本课题选取hsa-miR-124a-3p作为目标分子,拟建立基于母体血液标志物hsa-miR-124a-3p的DS产前筛查的无创产前检查(noninvasive prenatal testing,NIPT)检测新方法。研究内容包括以下两部分:(1)血浆hsa-miR-124a-3pRT-qPCR检测方法的建立;(2)母体血浆hsa-miR-124a-3p在DS产前筛查中的临床应用效能评价。目的:1.构建和优化血浆hsa-miR-124a-3p的RT-qPCR检测方法。2.探讨母体血浆hsa-miR-124a-3p在DS产前筛查中的临床应用价值。方法:选取hsa-miR-124a-3p作为研究目标分子,设计和合成hsa-miR-124a-3p逆转录引物及标准品,利用Taq Man?Small RNA assays、TaqMan?master mix with UNG等荧光定量PCR扩增试剂,建立hsa-miR-124a-3p的RT-qPCR检测方法,并对反应体系和反应条件进行优化和性能评价。利用建立的方法对36例健康胎儿母体血浆、11例唐氏综合征胎儿母体血浆的hsa-miR-124a-3p的表达水平进行检测,并对二者的检测结果进行统计学分析。同时将hsa-miR-124a-3p检测结果与临床常用的血清唐氏筛查方法进行比较。结果:1.设计和合成了hsa-miR-124a-3p逆转录引物,确定引物的最佳工作浓度为100pmol/μL。2.合成了hsa-miR-124a-3p的标准品并对其质量进行了验证,结果表明hsa-miR-124a-3p的标准品质量合格,可用作RT-qPCR的标准品。3.利用hsa-miR-124a-3p的标准品构建了hsa-miR-124a-3pRT-qPCR检测的标准曲线并对其进行了评价,证明其符合要求。4.构建和优化了血浆hsa-miR-124a-3pRT-qPCR检测方法并对其进行了方法学评价,确定其线性范围为1×10-2至1×10-6pmol/μL、检测下限为1×10-8pmol/μL、能够特异检测出hsa-miR-124a-3p的循环数为35个,且检测重复性良好。5.检测并比较了hsa-miR-124a-3p在DS患儿和健康胎儿母体血浆中的表达水平,DS妊娠组的hsa-miR-124a-3p浓度显著高于正常对照组。6.确定了hsa-miR-124a-3p预测DS妊娠高危风险的浓度区间值为10-5至10-3pmol/μL。7.对hsa-miR-124a-3pRT-qPCR检测方法和唐氏筛查进行了比较,结果提示hsa-miR-124a-3p在DS妊娠风险预测的价值中等,但比常规血清唐氏筛查方法高。结论:1、成功建立了定量检测血浆中hsa-miR-124a-3p的RT-qPCR方法。2、hsa-miR-124a-3p在DS胎儿母体血液中的表达异常增高,强烈提示hsa-miR-124a-3p可能是DS妊娠特异相关的母体血液新标志物。3、成功将10-5至10-3pmol/μl确定为hsa-miR-124a-3p检测方法的DS高危风险的区间值,为hsa-miR-124a-3p在DS妊娠产前筛查中的应用奠定了基础。4、hsa-miR-124a-3p预测DS的临床价值较唐氏筛查更高。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R714.5

【参考文献】