氧化苦参碱通过miR-125b-STAT3途径抑制卵巢癌细胞增殖与侵袭的研究

发布时间：2018-03-25 12:20

本文选题：上皮性卵巢癌　切入点：氧化苦参碱　出处：《河北医科大学》2015年博士论文

【摘要】：目的:上皮性卵巢癌是妇科生殖道肿瘤中致死率最高的一种恶性肿瘤,据统计2015年美国将有21290例新发病例和14180例死亡病例。该病起病隐匿,初诊者中70%已属晚期,从而失去最佳手术时机。即使能手术,术后也极易复发。即使手术彻底,肉眼见不到的肿瘤结节和数量不等的癌细胞仍然会有残留,如不及时治疗,残留的癌细胞将成几何级数增长,更何况晚期卵巢癌病变多已累及盆腔内的许多脏器造成致密的癌性粘连,尤其是重要脏器如肝脏的转移或肠系膜根部的转移等,手术不能彻底切除病灶,手术更不能解决远处转移,因此化疗已成为卵巢癌根治的一部分,患者的预后在很大程度上取决于对化疗的敏感性。近半个多世纪以来,化疗药也历经变迁,上世纪中期主要采用烷化剂及抗代谢药物治疗,1970s年代后期单药顺铂开始应用于临床,1982年美国M.D.Anderson Cancer Center开始应用PAC(顺铂、阿霉素、环磷酰胺)方案。联合方案较单一顺铂方案使患者的生存率提高了15%。1990年初,紫杉醇问世,1996年GOG111经研究宣布TP(紫杉醇、顺铂)方案优于PC方案。1999年,GOG证实紫杉醇与卡铂联合联合化疗的毒副作用较紫杉醇与顺铂联合作用轻,两者的疗效无显著区别。2011年将抗血管生成药物贝伐单抗(bevacizumab)引入临床。卵巢癌是对化疗药高度敏感的肿瘤,随着化疗药物的每一次进步,卵巢癌患者的5年生存率不断得到提高。尽管卵巢癌对化疗药高度敏感,且大部分患者在治疗初期都能得到缓解,但多数患者都会复发,一般平均复发时间在18个月。患者最终会出现耐药,最后死于无药可治。由于化疗是卵巢癌中重要的不可缺少的治疗手段,故针对卵巢癌的致癌靶点,研发新的抗肿瘤药物是解决卵巢癌治疗问题的重要途径。Micro RNAs(mi RNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的高度保守的具有调控功能非编码小RNAs,其长度为19-25个核苷酸,通过在转录后水平靶向作用于m RNAs降解靶m RNA或者阻遏靶m RNA的翻译。目前已发现其成员超过1000个,调控至少30%以上的基因表达。一个mi RNAs可以作用于多个m RNAs,很多编码蛋白质的基因都受其调控。而几个mi RNAs也可以调节同一个m RNA。mi RNAs在调节基因表达中起重要作用。一旦mi RNA表达失衡将可能导致疾病的发生。mi RNA表达的变化可以引起多个m RNAs表达谱的改变,继而引起细胞功能的变化。已有多项研究表明,mi RNA是许多生理过程的主要调控者,参与胚胎发育、器官形成,以及细胞的增殖、分化、细胞周期进程及凋亡等。其异常表达常与许多疾病包括癌症的发生有关。在肿瘤中,mi RNAs常常发生扩增或缺失,导致肿瘤抑制蛋白的表达减少或癌蛋白的过度表达。许多mi RNA位于基因组的脆性位点或肿瘤相关区域,如染色体断裂点的区域、发生杂合性缺失的区域、以及发生扩增和重排的区域等。因此,特定mi RNA的表达异常与肿瘤发生密切相关。其中mi RNA125b(mi R-125b)在癌症研究领域引起了学者们的关注。成熟的mi R-125b由mi R-125b-1和mi R-125b-2两个基因产生,这两个基因都位于染色体的脆性部位,在乳腺癌、卵巢癌和宫颈癌中常发生缺失。全基因组mi RNA表达谱分析表明mi R-125b在卵巢癌中是异常表达的。已有研究表明在裸鼠中mi R-125b的过表达可以降低人卵巢癌细胞的增殖,抑制卵巢癌细胞的生长,mi R-125b的降调与卵巢癌细胞的侵袭增强和不良预后有关。这说明mi R-125b的异常表达在卵巢癌发生发展过程中的重要作用,但其下游靶基因及详细作用机制尚待阐明。我们应用生物信息学工具Pictar(http://pictar.Bio.nyu.edu/),Targetscan(http//www.targetscan.org/),以及Mi Randa(http://www.Microma.org/)等对mi R-125b的可能靶基因进行了预测,预测结果显示:STAT3(The transcription factor signal transducer and activator of transcription 3)编码区存在mi R-125b的作用靶点,因此STAT3很可能是mi R-125b的下游靶基因,但调控作用尚需进一步验证。信号转导子和转录激活子(Signal Transducer and Activator of Transcription,STAT)家族是潜在的胞质转录因子,在细胞中既能传递胞浆信号又起到启动核内基因转录的功能。其中STAT3(The transcription factor signal transducer and activator of transcription 3)信号转导通路直接影响细胞的增殖、分化及凋亡过程。在正常情况下,STAT3蛋白的激活是快速的、短暂的。该通路异常活化可导致细胞异常增殖和恶性转化。在人类许多类型的肿瘤中,均有其异常的持续激活和高表达,从而通过c-myc、cyclin D1、survivin和Bcl家族等途径促进细胞增殖,抑制细胞凋亡。许多癌症细胞株和原发肿瘤包括卵巢癌中都报道有持续激活的STAT3(p STAT3),导致细胞转化和肿瘤发生。氧化苦参碱(oxymatrine,OMT)分子式C15H24N2O2,分子量为264.36,是传统中药苦参的有效成分,属于四环喹诺里西啶类(quinol-izidine)生物碱,性寒味苦,有清热解毒,明目止泪,燥湿利尿,祛风杀虫,安五脏,转身定志等作用。现代医学证明其具有较好的抗肿瘤活性,还具有抗炎、抗病毒、抗纤维化、免疫调节等多种药理作用。近年来其抗肿瘤活性引起了学者们的关注。体外实验表明氧化苦参碱能抑制肿瘤细胞增殖、诱导周期阻滞、促进细胞凋亡、诱导肿瘤细胞分化、抗肿瘤新生血管形成以及抑制肿瘤侵袭和转移,对多种肿瘤细胞具有杀伤或抑制作用。目前其针对肝癌细胞、白血病细胞的研究较为广泛,对肠癌、宫颈癌、卵巢癌的研究也有报道,但多停留于表象,缺乏对其分子机制的深入研究。卵巢癌是一种异质性疾病,其病理类型较为复杂。其中上皮性卵巢癌占原发卵巢肿瘤的90%,主要分为浆液性、粘液性、子宫内膜样、透明细胞、移行细胞、混合性和未分化癌。浆液性卵巢癌占卵巢癌的75%。不同亚型的卵巢癌具有不同的分子改变及不同的生物学特性,对药物反应也不尽相同。在本实验中我们选取常见的浆液性卵巢癌细胞株SKOV3,观察OMT能否抑制其增殖及侵袭,并探讨其作用的分子机制是否通过mi R-125b-STAT3途径。mi R-125b-STAT3方法:1选取FIGO III期浆液性卵巢癌组织标本5例,取正常卵巢组织为对照,采用RT-PCR法分别测定两种组织中mi R-125b及STAT3m RNA的表达,用Western blot测定两种组织中STAT3的蛋白表达水平,初步探讨mi R-125b及STAT3分别在浆液性卵巢癌组织与正常卵巢组织中表达的差异性。2为研究OMT应用于卵巢癌治疗的可行性,本研究在细胞水平探讨OMT对SKOV3细胞增殖、侵袭能力的影响,选取不同浓度OMT作用于SKOV3细胞不同时间后,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测OMT对SKOV3细胞生长的影响;采用Transwell小室检测OMT对SKOV3细胞侵袭能力的影响。3不同浓度的OMT作用于SKOV3细胞后,采用RT-PCR及Western blot方法检测细胞中VEGF、cyclin D1、p21、p27以及MMP2/MMP9表达情况的变化,探讨OMT对SKOV3细胞增殖与侵袭能力影响的的分子机制。4为进一步研究OMT对SKOV3细胞增殖与侵袭能力影响的作用机制,本实验采用了RT-PCR及Western blot方法分别检测不同浓度OMT作用于SKOV3细胞后mi R-125b的表达情况以及STAT3 m RNA、蛋白的表达情况。5分别将mi R-125b-mimic、anti-mi R-125b转染至SKOV3细胞中,检测相应的STAT3 m RNA、蛋白的变化及对SKOV3细胞增殖与侵袭能力的影响。结果:1 RT-PCR及Western blot检测结果均提示,浆液性卵巢癌组织中mi R-125b的表达水平明显低于正常卵巢组织,而STAT3的表达水平明显高于正常卵巢组织。2不同浓度OMT作用于SKOV3细胞不同时间后,OMT组SKOV3细胞的OD值均较对照组明显减低,且表现出时间浓度依赖性。同时,Transwell小室实验结果显示,不同浓度OMT作用于SKOV3细胞不同时间后,OMT组的穿膜细胞数均明显少于对照组。3不同浓度的OMT作用于SKOV3细胞后,VEGF、cyclin D1的表达水平均低于对照组,且随着OMT浓度的升高,VEGF、cyclin D1的表达逐渐降低,呈现浓度依赖性。不同浓度的OMT作用于SKOV3细胞后,p21、p27的表达水平均高于对照组,且随着OMT浓度的升高,p21、p27的表达逐渐升高,呈现浓度依赖性。不同浓度的OMT作用于SKOV3细胞后,MMP2,MMP9的表达水平均低于对照组,且随着OMT浓度的升高,MMP2,MMP9的表达逐渐降低,呈现浓度依赖性。4不同浓度的OMT作用于SKOV3细胞后,mi R-125b的表达均较对照组明显升高,且随着OMT浓度的增高,mi R-125b的表达逐渐升高;而STAT3 m RNA的表达均较对照组明显降低,且随着OMT浓度的增高,STAT3 m RNA的表达逐渐降低,与mi R-125b呈现反向变化。Western blot结果显示,不同浓度的OMT作用于SKOV3细胞后,STAT3蛋白的表达均明显低于对照组,与以上PCR结果相一致,随着OMT浓度的增高,STAT3蛋白的表达逐渐降低,呈现浓度依赖性。5当SKOV3细胞成功转染mi R-125b-mimic后,STAT3 m RNA及蛋白的表达均较对照组明显降低。采用MTT法检测mi R-125b-mimic组与对照组SKOV3细胞的OD值变化情况,结果发现,mi R-125b-mimic组的OD值均明显低于对照组;同时,Transwell小室实验结果表明mi R-125b-mimic组SKOV3细胞的穿膜细胞数显著少于对照组。然而,在转染anti-mi R-125b的SKOV3细胞中,STAT3m RNA及蛋白的表达均较对照组明显升高。MTT实验显示anti-mi R-125b组SKOV3细胞的OD值明显高于对照组,Transwell小室结果显示,anti-mi R-125b组SKOV3细胞的跨膜数明显高于对照组。推测OMT可能通过mi R-125b影响SKOV3细胞的增殖、侵袭能力。OMT mi R-125b结论:1氧化苦参碱对卵巢癌SKOV3细胞的增殖及侵袭具有抑制作用。2氧化苦参碱可能是通过mi R-125b-STAT3途径调控STAT3相关的增殖基因VEGF、cylclin D1、p21、p27及STAT3相关的侵袭基因MMP2、MMP9的来抑制SKOV3细胞的增殖和侵袭能力。3 mi R-125b-STAT3可作为卵巢浆液性癌的治疗靶点,氧化苦参碱可做为治疗卵巢浆液性癌的候选新药。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.31

【参考文献】