孕期吸烟对SD大鼠胚胎心脏发育的影响及表观遗传学调控机制

发布时间：2018-04-01 08:27

本文选题：孕期吸烟　切入点：乳鼠　出处：《南方医科大学》2014年硕士论文

【摘要】：先天性心脏病简称为先心病,主要类型包括：房间隔缺损,室间隔缺损,心室双流出通道,主动脉骑跨于右心室,三尖瓣返流、心室发育不良和先天性室壁肥厚等。大多数类型的先天性心脏病可伴随着儿童发育的终生,导致先心病儿童的住院率和死亡率增加。目前,先天性心脏病的发病因素主要包括先天性的遗传因素和胚胎发育的环境因素,遗传因素包括基因突变、DNA序列改变、染色体数目异常等。随着环境污染的加重,环境因素逐渐成为先天性心脏病的主要发病因素之一。现有的研究表明先天性心脏病相关的危险因素主要有：母亲在妊娠早期感染病毒、服用致畸性的药物、饮酒、主动吸烟或暴露在被动吸烟的环境中、接触甲醛或化学试剂等。吸烟是心血管系统疾病的相关危险因素之一,Geelhoed等人的研究结果表明,孕妇在怀孕期间持续吸烟5支／天时,其胎儿的脐动脉阻力升高,升主动脉血流量和主动脉根部内径减小,这些心血管系统结构和血流量的改变很可能与胎儿的体重下降相关。此外,现有的研究发现吸烟还是妊娠期胎儿先天性心脏锥干畸形、肺静脉异位回流、房室间隔缺损以及阻塞性心脏缺陷的相关危险因素,其发生的机制尚未清楚。已有的研究表明,心脏关键转录因子GATA4、Tbx5、Nkx2.5和Baf60c在心脏的正常发育过程中发挥着重要的作用。首先,染色质重塑复合物Baf60c能够改变心脏目的基因的紧密结构,介导GATA4、Tbx5和Nkx2.5等心脏关键转录因子与目的基因结合,从而促进心脏的发育。其次,GATA4能与Tbx5和Nkx2.5发生相互作用,调控心肌细胞的分化和增殖。心脏关键转录因子GATA4、Tbx5、Nkx2.5和Baf60c的表达异常或功能缺失可导致不同类型的先天性心脏病如房间隔缺损、室间隔缺损、单心室和双心室流出通道等。然而,转录因子与心脏目的基因的结合能力和Baf60c的表达水平与基因组组蛋白的甲基化状态相关。UTX是组蛋白H3的27位赖氨酸位点三重甲基化H3K27me3的去甲基化酶,一方面,UTX能够去除Baf60c增强子上抑制性的H3K27me3,从而调节Baf60c的表达；另一方面,UTX能够去除心脏关键基因上的H3K27me3,促进心脏关键转录因子GATA4、Tbx5、Nkx2.5和Brg1与目的基因结合,从而激活心脏基因的表达和心脏的发育。综上所述,心脏关键转录因子(T)、Baf60c(B)和UTX(U)组成的调控网络在心脏的正常发育过程中发挥着关键的作用,这属于表观遗传学的范畴。首先,心脏关键转录因子和染色质重塑复合因子Baf60c的正常表达量是心脏关键基因激活的基础；其次,UTX和其介导的组蛋白H3K27去甲基化修饰是心脏发育的一个关键环节,其机制主要包括两个方面,一方面,UTX调控染色质重塑复合因子如Baf60c的表达,从而改变染色体的紧密结构,促进Baf60c介导的心脏关键转录因子与心脏目的基因结合,另一方面,其能够通过去除心脏关键基因上抑制性的H3K27me3,易化心脏关键转录因子和Brgl与目的基因结合,启动心脏的正常发育途径。尽管吸烟是先天性心脏病的相关危险因素,而TBU是正常心脏发育关键调控网络,然而,目前尚缺乏对吸烟相关的心脏发育不良的实验研究及其与TBU之间的关系的探讨。本论文采用SD怀孕大鼠为实验材料,研究早期接受被动吸烟和尼古丁干预对大鼠胚胎心脏结构与功能的影响,并探讨其分子和表观遗传学机制,为先天性心脏病的预防及表观分子靶点的预测提供基础。本论文的第一部分将SD怀孕大鼠置于全自动被动吸烟装置内进行被动吸烟处理,采用高分辨率超声Doppler观察出生一天后的乳鼠左心室结构和左右心室血流状况。第二部分于怀孕后8.5天(GD8.5)、GD13.5和出生后一天采集各组的大鼠胚胎或乳鼠心脏组织,提取RNA或蛋白,检测心脏关键转录因子GATA4、 Nkx2.5、Tbx5、染色质重塑复合因子Baf60c、组蛋白修饰酶UTX和心脏关键基因Myl2的表达水平,以阐明被动吸烟与心脏发育不良的关系,并探讨其分子和表观遗传学调控机制。第三部分选取香烟中的有害物质尼古丁在早期对怀孕SD大鼠进行灌胃处理,于出生一天后采用高分辨率超声Doppler观察乳鼠左心室结构,并且采集该时期各组乳鼠心脏组织,采用Western-Blot检测乳鼠心脏关键转录因子GATA4和Tbx5的表达情况,以验证尼古丁是否可以影响心脏的发育及其对心脏关键转录因子的影响。第一部分孕期吸烟对SD大鼠胚胎心脏发育的影响目的：观察孕期吸烟对SD大鼠胚胎心脏发育的影响及心脏异常发育的类型。方法：将怀孕SD母鼠随机分为四组：正常对照组,10支烟/天/组、20支烟/天/组、40支烟/天/组,并于孕期0.5天(GD0.5)后开始给予吸烟处理直至分娩。采用超声多普勒Vevo2000检测出生后一天(PND1)的新生乳鼠的左心室结构及其心脏功能；采用Color-Doppler检测心室血流方向,以确认室间隔的发育是否异常；采用精密电子天平记录PND1的新生乳鼠的体重和心脏重量,并计算心脏重量/体重比值。采用HE染色技术观察乳鼠的心脏室壁发育情况。结果：(1)各组新生乳鼠心脏重量无明显差异,40支烟/天/组的乳鼠体重由正常对照组的5.75±0.35g下降至3.94±0.37g,差异具有统计学意义(n=12,p0.001)；(2)10支烟/天/组的左心室舒张末期后壁厚度下降至0.40±0.08mm,与对照组相比,差异具有统计学意义(n=7,p0.05)；20支烟/天/组的左心室收缩末期前壁厚度、舒张末期后壁厚度和左心室最大重量分别下降至0.68±0.23mm、0.35±0.08mm和11.91±2.87mg,与对照组相比,差异具有统计学意义(n=8,p0.05)；当吸烟的剂量达到40支烟/天时,左心室舒张末期/收缩末期前壁厚度、左心室舒张末期/收缩末期后壁壁厚度和左心室最大重量分别下降至0.36±0.09mm/0.71±0.16mm、0.37±0.06mm/0.65±0.12mm和11.43±3.89mg,与正常对照组相比,差异具有统计学意义(n=13,p0.05)。 (3) Color Doppler结果显示,20支烟/天/组和40支烟/天/组乳鼠左、右心室血流呈现分流现象,并且在血流融合处形成绿色的杂色血流,提示室间隔缺损。 (4)HE染色结果提示,经过中等剂量的被动吸烟处理后,乳鼠的心脏室壁厚度变薄。结论：孕期持续高剂量吸烟至分娩,乳鼠体重明显下降,并且左心室室壁厚度变薄,乳鼠的左右心室血流呈现分流现象,提示室间隔缺损。因此,孕鼠在妊娠期间接受被动吸烟与左心室发育不良和室间隔缺损等现象相关。第二部分吸烟相关的心脏发育不良表观遗传学机制目的：探讨与吸烟相关的心脏发育不良的表观遗传学和分子调控机制。方法：于GD8.5、GD13.5和PND1收取大鼠胚胎或乳鼠的心脏组织,于GD8.5检测各组胚胎的GATA4和C-kit mRNA整体表达情况；提取GD13.5胚胎心脏RNA进行Real-time PCR检测心脏关键转录因子、染色质重塑复合因子Baf60c、去甲基化酶UTX和心脏特异标志物My12的表达情况；提取PND1的乳鼠心脏组织蛋白进行Western-Blot检测GATA4、Tbx5和My12的表达量,同时检测组蛋白H3K27me3的差异情况。结果：(1)GD8.5Real-time PCR结果显示,40支烟/天/组胚胎心脏C-kit和GATA4mRNA的整体表达水平呈现下调趋势,其中GATA4mRNA的相对表达量由正常对照组的0.975±0.195下降至0.588±0.330,下调幅度较大,但差异无统计学意义(n=6,p0.05)；C-kit的mRNA相对表达量由正常对照组的1.0523±0.111下降至0.760±0.217,差异具有统计学意义(n=6,p0.05)。 (2) GD13.5Real-time PCR结果显示,吸烟能够导致心脏转录因子GATA4mRNA相对表达量出现剂量下调现象,10支烟/天/组、20支烟/天/组和40支烟/天/组胚胎心脏GATA4mRNA相对表达量由正常对照组的1.104±0.192分别下降为：0.88±0.153、0.825±0.089和0.485±0.181,差异均具有统计学意义(n=6, p0.05; p0.01; p0.001);20支烟/天/组和40支烟/天/组胚胎心脏Baf60c mRNA相对表达量由正常对照组的1.155±0.166分别下降为：0.67±0.091和0.341±0.191,差异均具有统计学意义(n=6,p0.001)。 (3) GD13.5Real-time PCR结果显示,10支烟/天/组和20支烟/天/组胚胎心脏Tbx5mRNA相对表达量反馈上调至2.449±0.356和2.175±0.248,差异具有统计学意义(n=6,p0.001)；然而,当吸烟剂量达到40支烟/天/组时,Tbx5的mRNA表达量显著下降至0.688±0.149,差异具有统计学意义(n=6,p0.001)。 (4) GD13.5Real-time PCR结果显示,Nk×2.5mRNA相对表达量由1.425±0.428反馈上调至10支烟/天/组和20支烟/天/组的2.551±0.363和2.282±0.446,差异具有统计学意义(n=6,p0.001)；当孕鼠吸烟剂量达到40支烟/天时,心脏关键转录因子Nkx2.5的mRNA相对表达量下降至0.861±0.278,差异具有统计学意义(n=6,p0.05)。 (5) GD13.5Real-time PCR结果显示,当吸烟剂量增加至40支烟/天时,该时期胚胎心脏组织My12mRNA由正常对照组的1.189±0.214下降至0.533±0.163,差异具有统计学意义(n=6,p0.001)。 (6) GD13.5Real-time PCR结果显示,10支烟/天/组、20支烟/天/组和40支烟/天/组胚胎心脏UTX mRNA表达量由正常对照组的1.267±0.411分别下调至0.928±0.307,0.672±0.096和0.521±0.139,差异均具有统计学意义(n=6,p0.05；p0.01；p0.001)；40支烟/天/组胚胎心脏Jmjd3mRNA表达量由对照组的1.123±0.199,下降至0.600±0.262,差异具有统计学意义(n=6,p0.001)。 (7)PND1的Western-Blot结果显示,10支烟/天/组、20支烟/天／组和40支烟/天/组心肌关键转录因子GATA4蛋白表达水平呈现剂量下调现象,其中40支烟/天/组GATA4/GAPDH比值由正常对照组的0.654±0.0831,下降至0.455±0.0324,与正常对照组相比,差异具有统计学意义(n=5,p0.05)。40支烟/天/组Tbx5/GAPDH比值由正常组的0.442±0.0281下降至0.350+0.0624；与对照组相比,差异具有统计学意义(n=5,p0.05) (8)PND1的Western-Blot结果显示,随着被动吸烟剂量增加至40支烟/天,My12/GAPDH比值由正常对照组的0.298±0.0923下调至0.164±0.0557,与对照组相比,差异具有统计学意义(n=5,p0.01) (9)PND1的Western-Blot结果显示,20支烟/天/组和40支烟/天/组乳鼠心脏组组织H3K27me3/H3比值由正常对照组的0.464±0.103分别上调至0.893±0.332和1.024±0.150,与对照组相比,差异具有统计学意义(n=5,p0.01)。结论：孕母鼠接受被动吸烟至怀孕中期可致胚胎心脏GATA4、Baf60c和UTX表达量呈现剂量下调现象,一方面,UTX的表达量下调抑制Baf60c的表达,另一方面,UTX的表达量下调导致Tbx5和Nkx2.5与目的基因结合,从而反馈调节Tbx5和Nkx2.5的表达上调,但当吸烟剂量达到40支烟/天时,Tbx5和Nkx2.5的表达呈现抑制状态,以致出生后仍然呈现抑制状态。因此,吸烟一方面能够抑制心脏关键转录因子GATA4、Tbx5和Nkx2.5的表达,另一方面能够导致UTX呈现剂量下调现象,UTX的表达量下调能够抑制Baf60c的表达和组蛋白的H3K27me3修饰,从而抑制GATA4、Tbx5和Nkx2.5与心脏关键基因My12启动子结合,抑制My12的表达,吸烟所致的左心室室壁厚度下降和室间隔缺损很可能与TBU调控网络的异常抑制相关。第三部分尼古丁对SD大鼠胚胎心脏发育的影响及分子机制目的：研究尼古丁对SD大鼠胚胎心脏发育的影响并探讨其分子机制。方法：将怀孕大鼠随机分为三组：正常对照组、10mg nicotine/kg/day组和20mgnicotine/kg/day组。于GD0.5分别给予去离子水或浓度为1.0mg/ml和2.0mg/ml的尼古丁溶液灌胃处理,于PND1采用超声多普勒Vevo2000检测新生乳鼠的左心室结构及其心脏功能；采用Color-Doppler检测心室血流方向,以确认室间隔的发育是否异常；采用精密电子天平记录PND1的新生乳鼠的体重和心脏重量,并计算心脏重量/体重比值；收取PND1的乳鼠心脏组织,采用Western-Blot的方法观察各组乳鼠心脏关键转录因子GATA4和Tbx5的表达变化。结果：(1)20mg nicotine/kg/day组的心脏重量轻微下降,但与正常对照组相比,无统计学差异(n=11,p0.05)；10mg nicotine/kg/day组的乳鼠体重由正常对照组的5.49±0.44g上升至6.87±0.67g,与正常对照组相比,差异具有统计学意义(n=12,p0.001),20mg nicotine/kg/day组乳鼠体重下降至4.70±0.36g,与对照组相比,差异具有统计学意义(n=11,p0.01)；心脏重量/体重比值分别为：0.0058±0.00098,0.0049±0.00051,0.0062±0.00087,其中,20mg nicotine/kg/day组心脏重量/体重比值呈现轻微上调,与正常对照组相比,差异无统计学意义(n=11,p0.05)。 (2)当尼古丁的剂量达到20mg nicotine/kg/天时,左心室舒张末期/收缩末期前壁厚度分别由正常组的0.61±0.19mm和1.03±0.17mm下降至0.44±0.13mm和0.84±0.09mm,与正常对照组相比,差异具有统计学意义(n=8,p0.05)左心室舒张末期后壁壁厚度由正常对照组的0.58±0.14mm下降至0.44±0.06mm,与正常对照组相比,差异具有统计学意义(n=8,p0.01)；左心室最大重量由正常对照组的24.03±6.73mg下降至11.88±1.81mg,与正常对照组相比,差异具有统计学意义(n=8,p0.01)。 (3) Western-Blot的结果显示：当尼古丁剂量增加至20mg nicotine/kg/天时,乳鼠心脏组织的GATA4和Tbx5表达量呈现下降趋势。结论：尼古丁对SD乳鼠发育的影响可表现为体重的增加或下降,与摄取尼古丁的剂量相关；尼古丁对心脏发育的影响表现为左心室室壁厚度和左心最大重量的下降,其很可能与GATA4和Tbx5表达下调相关。孕早期吸烟或摄取尼古丁对大鼠胚胎心脏发育的影响有很大的相似性,因此,香烟中的尼古丁很可能是导致乳鼠心室结构异常发育的有害化学物质。全文小结 1.母鼠孕期吸烟至正常分娩,乳鼠的心脏结构改变为：室壁厚度和左心室最大重量下降；孕期被动吸烟可导致乳鼠室间隔发育不全。 2.孕期被动吸烟可抑制TBU心脏调控网络,并使基因组启动子区域H3K27me3富集,从而影响心脏的发育。 3.孕鼠在妊娠期间摄取高剂量的尼古丁可导致GATA4和Tbx5的表达下调,其与心脏异常发育相关。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R714.2

【参考文献】