shRNA靶向诱导maspin基因启动子甲基化调控子痫前期滋养细胞浸润的研究
本文选题：子痫前期 切入点：胎盘 出处：《华中科技大学》2015年博士论文
【摘要】：第一部分 子痫前期中maspin的表达及其启动子甲基化状态的研究目的：本部分研究maspin蛋白在子痫前期患者胎盘组织中的表达水平及maspin基因启动子区的甲基化状态；利用体外实验研究缺氧时绒毛外滋养细胞中maspin基因启动子区的甲基化程度,探讨maspin基因启动子区甲基化在子痫前期发病机制中的作用。方法：选取12例子痫前期患者作为子痫前期组,同时选12例正常妊娠孕妇作为对照组,两组患者既往均无高血压等内外科疾病,子痫前期诊断标准参照谢幸主编的《妇产科学》第八版。以正常胎盘组织作为对照,运用Western blot方法检测子痫前期胎盘组织中maspin蛋白的表达水平。提取子痫前期胎盘组织、绒毛外滋养细胞株(TEV-1)的基因组DNA,经亚硫酸氢钠修饰,采用甲基化特异性PCR和亚硫酸氢盐测序等分子生物学方法检测子痫前期患者胎盘中和缺氧状态下绒毛外滋养细胞株中maspin基因启动子区域的甲基化情况。应用统计学软件SPSS 18.0进行统计学分析,P值小于0.05为差异具有统计学意义。结果：子痫前期组胎盘组织中maspin蛋白的表达水平明显高于对照组,在子痫前期胎盘组织中maspin启动子区域呈现低甲基化状态,差异有统计学意义(P0.05)。缺氧状态下脱甲基化药物(5-Aza-dC)可以使绒毛外滋养细胞株TEV-1的maspin基因启动子区域甲基化水平明显降低,差异有统计学意义(P0.05)。结论：子痫前期患者胎盘maspin蛋白表达明显升高,而相应的maspin启动子区域呈现低甲基化状态。缺氧状态下脱甲基化药物5-Aza-dC可以使绒毛外滋养细胞株TEV-1的maspin基因启动子区域甲基化水平明显降低,因此maspin基因启动子区域甲基化及其表达水平的变化可能在子痫前期的发病机制中起到一定作用。第二部分 设计并合成靶向干扰maspin启动子区的shRNA并验证其对甲基化状态的影响目的：针对maspin基因的启动子区域设计特异性shRNA序列,构建重组腺病毒,转染至绒毛外滋养细胞株TEV-1,验证shRNA对maspin启动子甲基化的调控作用。方法：设计并合成靶向maspin基因启动子区的shRNA序列,构建4条shRNA质粒表达载体pGenesil-1.1-maspin,酶切鉴定及DNA测序。将maspin-shRNA表达框通过体外同源重组的方式转移至腺病毒表达载体上,将其转染293细胞进行包装,制备获得重组腺病毒。将鉴定正确的重组腺病毒转染至绒毛外滋养细胞TEV-1,观察细胞形态及GFP蛋白的表达,采用甲基化特异性PCR检测转染shRNA后TEV-1细胞中maspin基因启动子区的甲基化状态。结果：经酶切及DNA测序鉴定验证重组腺病毒rAd5-maspin-shRNA构建成功。并将其转染至TEV-1细胞,平均转染85%。与对照组相比,转染重组腺病毒rAd5-maspin-shRNA后,maspin基因启动子区的甲基化程度明显增高,差异有统计学意义。结论：成功构建的重组腺病毒rAd5-maspin-shRNA,能高效转染TEV-1细胞。shRNA靶向诱导maspin启动子甲基化状态由转染前的低甲基化转为高甲基化状态。第三部分shRNA靶向诱导maspin启动子甲基化对滋养细胞侵袭能力的影响研究目的：研究特异性shRNA靶向诱导maspm启动子甲基化对滋养细胞侵袭、迁移能力的调控作用。方法：应用实时荧光定量PCR法检测转染后各组maspm基因的mRNA水平,Western blot印迹法检测maspm蛋白的表达情况,利用Transwell体外迁移和侵袭实验检测转染后各组TEV-1细胞迁移和侵袭能力的变化。结果：转染特异性重组腺病毒rAd5-maspin-shRNA后,TEV-1细胞中maspin mRNA和蛋白的表达水平明显下降(0.05),此外转染后TEV-1细胞迁移和侵袭能力较对照组明显增强,差异有统计学意义。结论：重组maspin腺病毒rAd5-maspin-shRNA能有效地抑制maspin基因在TEV-1细胞株中的表达,同时明显增强滋养细胞株TEV-1的迁移和侵袭能力。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R714.244
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9 董e，
本文编号：1728109
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