DNA损伤修复基因MCM8在原发性卵巢功能不全发病中的作用及机制研究
本文选题：POI + MCM8 ； 参考：《山东大学》2017年硕士论文
【摘要】：[背景]原发性卵巢功能不全(Primary ovarian insufficiency,POI)又称为卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF),是严重影响育龄期女性身心健康的常见生殖内分泌疾病之一。其临床特征主要表现为原发性闭经或40岁之前继发性闭经,并伴有高促性腺激素以及雌激素水平低下等一系列围绝经期表现。POI病因高度异质,已知病因包括染色体异常、基因突变、免疫因素、医源性损伤以及环境因素等,其中遗传学因素约占20%-25%。迄今为止,仅有少数基因通过功能研究证实其致病性,包括位于X染色体的BMP15、PGRMC1和FMR1基因,以及常染色体的FSHR、GDF9、NR5A、NOBOX、FIGLA和FOXL2等基因。近年来,国内外学者发现DNA损伤修复相关基因与女性早绝经、卵巢储备功能下降以及POI的发生密切相关,其中,微小染色体微粒蛋白8(Minichromosome maintenance complex component 8,MCM8)基因是研究热点之一。微小染色体微粒蛋白8是微小染色体微粒蛋白(Minichromosome maintenance complex component,MCM)家族成员,参与 DNA 复制、减数分裂和DNA双链断裂同源重组修复过程。Mcm8基因敲除雌鼠表现为卵母细胞减数分裂障碍,卵泡进行性减少,卵巢萎缩。Aleksandar Rajkovic等利用全外显子组测序在POI家系中发现MCM8纯合错义突变,并证实该突变破坏了染色体稳定性。但MCM8在散发性POI患者中的致病性尚未见报道。因此,我们在192例散发性POI患者中进行基因突变筛查,以明确MCM8与散发性POI相关性和致病机制。[目的]探讨MCM8与中国汉族散发性POI的相关性,并阐明致病机制。[方法]选择192例中国汉族散发性POI患者为病例组。入选标准包括:a.年龄在20-35岁;b.原发性或继发性闭经;c.促卵泡生成素(FSH)40IU/L;d.染色体核型为46,XX;e.无POI家族史。排除标准包括:既往有免疫性疾病、盆腔感染、卵巢手术、放化疗、其他医源性损伤等。同时收集312例中国汉族健康女性作为对照组(包括192例年龄匹配、月经规律的育龄期女性以及120例年龄45岁以上、FSH12 IU/L、双侧卵巢窦状卵泡数≥3个、月经规律的健康女性)。提取病例组和对照组女性外周血全基因组DNA,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增MCM8基因的19个外显子及相应侧翼序列,进行直接测序。将测序结果与Ensembl提供的正常碱基序列进行序列比对。针对新发现的变异类型设计DNA损伤修复实验,验证新发MCM8基因变异的致病性及机制。[结果]测序结果发现2个新发错义突变:c.A950T(p.H317L)和c.A1802(p.H601R),6 个已知单核苷酸多态位点(Single-nucleotide polymorphisms,SNP)(5 个非同义 SNP:rs236110、rs116926921、rs58487183、rs16991591、rs61752028,1个同义SNPrs3761873)。DNA损伤修复实验结果显示:与野生型HeLa细胞(WT)相比,过表达p.H317L以及p.H601R突变型MCM8的HeLa细胞(MT)对DNA损伤诱导剂丝裂霉素C(MMC)更为敏感,表现为磷酸化组蛋白H2A(γH2AX)表达水平明显上调。MMC处理后更换新培养基继续培养2小时,WT和p.H601R突变体γH2AX的表达水平明显降低或消失,而p.H317L突变体γH2AX的表达水平却没有明显变化,提示突变p.H317L和p.H601R均影响了 MCM8的DNA损伤修复功能,而p.H317L对MCM8蛋白DNA损伤修复能力影响更为显著。[结论及意义]首次在中国汉族散发性POI患者中发现MCM8基因突变,并通过功能实验证实突变p.H317L和p.H601R型MCM8 DNA损伤修复功能受损,由此推测该基因突变导致的卵母细胞减数分裂障碍可能是POI的致病机制之一。
[Abstract]:Abstract : Primary ovarian insufficiency ( POI ) is also known as ovarian failure ( POIs ) , which is one of the most common reproductive endocrine diseases in women ' s physical and mental health . Methods : 192 Chinese Han Chinese sporadic POI patients were selected as a case group . Inclusion criteria included : a . age ranged from 20 to 35 years ; b . primary or secondary amenorrhea ; c . FSH 40 IU / L ; d . chromosomal karyotype 46 , XX ; e . No family history of POIs . DNA was amplified by polymerase chain reaction ( PCR ) and sequenced . The results showed two new missense mutations : c . A 950 T ( p . H317L ) and c . A1802 ( p . H601R ) , 6 known single nucleotide polymorphisms ( SNPs ) ( 5 non - synonymous SNPs : rs236110 , rs116926921 , rs58487183 , rs169991 , rs617520 28 , 1 synonymous SNPrs3761873 ) . The results of DNA damage repair showed that overexpression of p . H317L and p . H601R mutant MCM8 were more sensitive than wild type HeLa cells ( WT ) .
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R711.75
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，本文编号：1748874
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