维甲酸诱导的马蹄内翻足胎鼠腿部及孕鼠胎盘组织中凋亡相关基因的表达研究

发布时间：2018-04-15 02:37

  本文选题：动物模型 + 凋亡　； 参考：《南京医科大学》2014年硕士论文

【摘要】：目的：利用全反式维甲酸建立马蹄内翻足胎鼠模型,研究畸形胎鼠的腿部组织及孕鼠胎盘组织中凋亡相关基因的表达情况。方法：将SD孕鼠按照随机数表法分为实验组与对照组,在孕鼠怀孕第10天,将12Omg/kg的全反式维甲酸溶于石蜡油中经灌胃方式给予实验组中的孕鼠,同时对照组中给予相同体积石蜡油灌胃。于孕鼠怀孕第20天在麻醉及无菌的条件下,将胎鼠经剖腹的方式取出,取胎鼠腿部组织并剥离取下胎盘。利用荧光定量PCR和Western Blot技术,分别检测胎鼠腿部组织中Bcl-2和BAX基因在mRNA水平及蛋白水平的表达情况,并应用Caspase-3试剂盒检测Caspase-3的相对活性。将新鲜胎盘组织制备成单细胞悬液,利用流式细胞技术检测其早期凋亡及晚期凋亡的情况；利用荧光定量PCR和Western Blot技术,分别检测胎盘组织中BCL-2和BAX基因在mRNA水平及蛋白水平的表达情况；包埋胎盘组织制备石蜡切片,利用免疫组化技术检测BCL-2和BAX的表达情况；应用Caspase-3试剂盒检测Caspase-3的相对活性。结果：在实验组中观察到胎鼠马蹄内翻足畸形,有的单足畸形,有的双足畸形,以及小颅、短尾、无尾、脊柱裂等畸形,而对照中未发现畸形的胎鼠。Bcl-2基因在实验组的胎鼠腿部组织中的mRNA水平和蛋白水平呈低表达(P0.05),而BAX基因的mRNA水平和蛋白水平呈高表达(P0.05)。实验组胎鼠腿部组织中的CASPASE-3相对活性较对照组相比增高(P0.05)。通过流式细胞检测到实验组胎盘组织中有促凋亡的发生。Bcl-2基因在实验组孕鼠胎盘中的raRNA水平和蛋白水平呈低表达(P0.05)且切片中染色较浅,而BAX基因在实验组中的mRNA水平和蛋白水平呈高表达(P0.05)且切片中染色较深。实验组中CASPASE-3相对活性较对照组相比增高(P0.05)。结论：畸形胎鼠腿部组织中凋亡相关基因Bcl-2、BAX和Caspase-3的表达异常可能与马蹄内翻足的发生有关。提示了先天性马蹄内翻足可能与神经肌肉等的异常凋亡有关。因此,对进一步研究CTEV的致病基因与发病机制提供了可能的研究方向。畸形胎鼠孕鼠胎盘组织中促凋亡的发生可能与马蹄内翻足的发生有关。揭示了子宫胎盘因素对马蹄内翻足发生的影响,对产前诊断为马蹄内翻足的胎儿进行早期干预治疗提供实验依据,为临床开展可能的针对性治疗及治疗方法的选择提供参考依据。
[Abstract]:Aim: to study the expression of apoptosis-related genes in the leg tissues and placental tissues of malformed fetal rats by using all-trans retinoic acid (ATRA) to establish a rat model of horseshoe varicose foetus.Methods: the SD pregnant rats were divided into experimental group and control group according to the random number table method. On the 10th day of gestation, all trans retinoic acid (ATRA) of 12Omg/kg was given to pregnant rats of experimental group by gavage in paraffin oil.At the same time, the control group was given the same volume of paraffin oil.On the 20th day of pregnancy, the fetal mice were removed by laparotomy under anaesthesia and aseptic conditions, and the leg tissue was removed and placenta was removed.Fluorescence quantitative PCR and Western Blot techniques were used to detect the expression of Bcl-2 and BAX genes in fetal rat leg tissues at mRNA level and protein level, respectively. Caspase-3 kit was used to detect the relative activity of Caspase-3.Single cell suspension was prepared from fresh placenta tissue, and its early and late apoptosis was detected by flow cytometry, and fluorescence quantitative PCR and Western Blot techniques were used.The expression of BCL-2 and BAX genes in placenta tissue was detected at mRNA level and protein level respectively. Paraffin sections were prepared from placenta and the expression of BCL-2 and BAX were detected by immunohistochemistry. The relative activity of Caspase-3 was detected by Caspase-3 kit.Results: in the experimental group, the fetal rat horseshoe varus foot deformity was observed, including one foot deformity, some bipedal deformity, small cranium, short tail, no tail, spina bifida and so on.However, no abnormal fetal mouse. Bcl-2 gene was found in the experimental group. The expression of mRNA and protein was low in the leg tissue of the experimental group, while the mRNA level and protein level of the BAX gene were highly expressed in the leg tissue of the experimental group.The relative activity of CASPASE-3 in the leg tissue of the experimental group was higher than that of the control group (P 0.05).The expression of raRNA and protein in placenta of experimental group was low (P0.05), and the staining of Bcl-2 gene was light in sections of placenta of experimental group, and the expression of Bcl-2 gene in placenta of experimental group was low (P0.05), and the expression of Bcl-2 gene in placenta of experimental group was low.BAX gene was highly expressed in the mRNA and protein levels of the experimental group (P0.05) and stained deeply in the sections.The relative activity of CASPASE-3 in the experimental group was higher than that in the control group (P 0.05).Conclusion: the abnormal expression of apoptosis-related genes Bcl- 2, Bax and Caspase-3 may be related to the development of horseshoe varus pedis.The results suggest that congenital equinovarus foot may be related to abnormal apoptosis of nerve and muscle.Therefore, it provides a possible research direction for the further study of the pathogenetic genes and pathogenesis of CTEV.Apoptosis in placenta of pregnant rats with malformation may be related to the development of equinovarus.The effects of uterine and placental factors on the occurrence of equinovarus were revealed, and the experimental basis was provided for the early intervention treatment of the fetus diagnosed as horseshoe varus before birth.To provide a reference for the clinical development of possible targeted treatment and the choice of treatment methods.
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R714.5

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本文编号：1752172