CLDN6通过AF-6抑制ERK信号通路对宫颈癌细胞侵袭的作用

发布时间：2021-03-16 18:59

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一,晚期转移是患者预后不良的主要原因。目前认为,宫颈癌主要通过局部侵袭和浸润的方式转移到周围组织器官及淋巴结。因此,研究宫颈癌的侵袭机制对于改善宫颈癌预后具有重要的意义。紧密连接蛋白CLDNs表达异常通过影响紧密连接结构、功能及相关细胞信号通路,在宫颈癌等上皮来源肿瘤的发生及转移等过程中发挥重要作用。CLDN6是CLDNs蛋白家族的27个成员之一,具有4个跨膜区,细胞浆内的羧基末端可与AF-6及ZOs等富含PDZ结构域的蛋白结合,参与细胞对外界信号的应答和细胞内信号的传递过程。其中AF-6是一种Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的调节蛋白,与Ras蛋白结合抑制ERK信号通路活化。我们前期工作中克隆了候选乳腺癌抑制基因CLDN6,发现CLDN6明显抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭能力;为了研究CLDN6作用机制,用基因芯片筛查和分析CLDN6靶基因和相关信号通路,发现过表达CLDN6抑制ERK信号通路。本课题组发现,CLDN6在宫颈癌细胞系中低表达,推测CLDN6表达沉默可能在宫颈癌的发生发展中发挥作用。目前关于宫颈癌细胞中CLDN6是否抑制宫颈癌细胞侵袭表型,CLDN6对宫颈癌细胞侵袭的影响是否与AF6/ERK信号通路有关尚未见报道。本文利用分子生物学等技术,研究CLDN6对宫颈癌细胞侵袭的作用及其机制,为宫颈癌治疗及控制早期转移提供新的靶点。方法1.建立过表达CLDN6的宫颈癌细胞稳定克隆构建p-EGFP-C1/CLDN6真核表达载体;利用脂质体法将CLDN6转染宫颈癌细胞HELA及C33A,利用G418筛选单细胞克隆;RT-PCR及Western-blot鉴定CLDN6表达水平;免疫荧光检测CLDN6表达的定位。2.CLDN6对宫颈癌细胞侵袭表型的影响(1)跨上皮电阻实验检测宫颈癌细胞的单层跨上皮电阻。(2)细胞划痕实验和Transwell小室法检测细胞体外迁移侵袭能力。(3)Western-blot和免疫荧光方法检测上皮标记物E-Cadherin及间质标记物N-Cadherin和Vimentin的表达及定位。(4)裸鼠移植瘤模型实验检测体内肿瘤生长能力;免疫组织化学方法检测移植瘤组织中E-Cadherin和Ki67的表达。3.CLDN6抑制宫颈癌细胞侵袭能力的作用机制(1)CLDN6对Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的影响:Western-blot法检测ERK及其上游基因MEK1/2及Ras蛋白活化状态;免疫荧光方法检测ERK的表达及定位。(2)ERK1/2信号通路激活剂PMA(Phorbol-12-myristate-13-acetate)对克隆组细胞侵袭能力的影响:(1)Western-blot法检测PMA作用的最适浓度及最适时间。(2)Transwell小室法检测PMA对克隆组细胞侵袭能力的影响;免疫荧光检测上皮及间质标记物的表达及定位。(3)CLDN6通过AF-6抑制ERK通路及对细胞侵袭的作用:(1)免疫荧光方法检测克隆组细胞AF-6蛋白表达定位;免疫共沉淀方法检测CLDN6与AF-6蛋白的结合状态。(2)RNAi技术沉默AF-6,免疫荧光及Western-blot验证沉默效果;Western-blot及免疫荧光方法检测ERK1/2与MEK1/2的活化状态;Transwell小室法检测细胞侵袭能力;免疫荧光法检测上皮及间质标记物的表达及定位。4.宫颈癌组织中CLDN6、p-ERK与E-Cadherin表达免疫组化方法检测CLDN6、p-ERK与E-Cadherin在56例宫颈癌组织中的表达,并分析p-ERK和E-Cadherin表达与CLDN6表达的相关性。结果1.建立稳定表达CLDN6的宫颈癌HELA及C33A细胞p-EGFP-C1/CLDN6质粒转染宫颈癌细胞HELA和C33A,并用G418筛选14天后,出现稳定表达CLDN6的单细胞克隆;克隆组CLDN6的m RNA及蛋白表达水平明显上调,并主要定位于细胞膜。2.检测过表达CLDN6对宫颈癌细胞侵袭表型的影响过表达CLDN6明显增加单层宫颈癌细胞的细胞间跨上皮电阻;降低宫颈癌细胞的体外侵袭迁移能力;上调细胞膜E-Cadherin表达,下调细胞质N-Cadherin及Vimentin表达;抑制裸鼠体内肿瘤生长能力,而移植瘤组织中Ki67表达下调,E-Cadherin表达上调。3.CLDN6抑制宫颈癌细胞侵袭能力作用机制(1)CLDN6对Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的影响:过表达CLDN6明显抑制ERK1/2及其上游基因MEK1/2的磷酸化水平及Ras的活性;ERK1/2由细胞核移位到细胞质。(2)ERK信号通路活化对细胞侵袭的影响:用100n M PMA处理细胞4h后,MEK1/2及ERK1/2的磷酸化水平明显增加;ERK1/2蛋白表达由细胞膜转向细胞核;细胞膜上的E-Cadherin表达下调,细胞质中的Vimentin表达上调;克隆组细胞的侵袭细胞数目显著增多。(3)CLDN6通过AF-6影响ERK通路的活化及侵袭作用:(1)空载组细胞AF-6表达主要定位于细胞质,克隆组AF-6表达主要定位于细胞膜;克隆组HELA及C33A细胞中可以检测到CLDN6与AF-6的结合。(2)沉默克隆组细胞AF-6后,AF-6蛋白在细胞膜上的表达水平明显降低;MEK1/2及ERK1/2的磷酸化水平均明显升高;细胞核中ERK蛋白明显增加,而细胞膜上的E-Cadherin表达下调,细胞质中的Vimentin表达上调;克隆组HELA及C33A细胞的侵袭细胞数目明显增多。4.宫颈癌组织中CLDN6、p-ERK与E-Cadherin表达56例宫颈癌组织中CLDN6的表达明显低于宫颈癌旁组织,并与淋巴结转移负相关;p-ERK在宫颈癌组织中高表达,与宫颈癌分化程度及淋巴结转移有关;p-ERK的表达与CLDN6呈负相关;E-Cadherin在宫颈癌组织中低表达,E-Cadherin的表达与宫颈癌分化程度及淋巴结转移有关;E-Cadherin与CLDN6的表达呈正相关。结论1.CLDN6可能通过逆转EMT抑制宫颈癌细胞的侵袭能力。2.CLDN6通过与AF-6结合,抑制ERK信号通路的活化可能是CLDN6发挥作用的机制之一。3.CLDN6和E-Cadherin的低表达及p-ERK的高表达在宫颈癌发生和发展中可能具有一定的作用。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.33

文章目录

前言

摘要

abstract

第一章绪论

1.1 紧密连接蛋白CLDNs的结构

1.2 CLDNs在人体正常组织中的分布

1.3 CLDNs在肿瘤组织中表达的研究现状

1.4 CLDNs在癌症发生中的作用

1.5 CLDNs与细胞信号通路的关系

1.5.1 CLDNs参与细胞信号传导的分子基础

1.5.2 CLDNs参与细胞信号传导的研究现状

1.6 CLDNs在癌症诊断中的应用

1.7 CLDNs在癌症治疗中的应用

1.8 结束语

第二章材料和方法

2.1 材料

2.1.1 主要试剂

2.1.2 主要仪器

2.1.3 试剂配制

2.1.4 实验动物

2.1.5 细胞系

2.2 实验方法

2.2.1 p-EGFP-C1/CLDN6真核表达载体的构建

2.2.2 CLDN6稳定转染宫颈癌细胞及其鉴定

2.2.3 CLDN6对宫颈癌细胞紧密连接功能的影响

2.2.4 CLDN6对宫颈癌细胞侵袭迁移能力的影响

2.2.5 CLDN6对宫颈癌细胞上皮间质转化的影响

2.2.6 CLDN6对宫颈癌细胞体内肿瘤生长能力的影响

2.2.7 CLDN6对Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的影响

2.2.8 ERK信号通路激活剂PMA处理宫颈癌细胞

2.2.9 PMA处理克隆组宫颈癌细胞对EMT的影响

2.2.10 免疫荧光方法检测宫颈癌细胞中AF-6 蛋白的表达定位

2.2.11 克隆组宫颈癌细胞中CLDN6与AF-6 的结合状态

2.2.12 RNAi方法沉默克隆组宫颈癌细胞中AF-6 基因

2.2.13 沉默AF-6 对宫颈癌细胞ERK信号通路的影响

2.2.14 Transwell小室法检测沉默AF-6 对宫颈癌细胞侵袭能力的影响

2.2.15 沉默AF-6 对克隆组宫颈癌细胞EMT的影响

2.2.16 CLDN6、p-ERK及E-Cadherin在宫颈癌组织中的表达及其与临床病理指标的联系

2.2.17 统计学方法

第三章结果

3.1 CLDN6稳定转染宫颈癌细胞及其鉴定

3.1.1 RT-PCR及Western-blot法鉴定转染效果

3.1.2 免疫荧光法检测CLDN6表达的定位

3.2 CLDN6对宫颈癌细胞侵袭表型的影响

3.2.1 CLDN6对跨上皮电阻的影响

3.2.2 CLDN6对细胞迁移能力的影响

3.2.3 CLDN6对细胞侵袭的影响

3.2.4 CLDN6对宫颈癌细胞上皮间质转化（EMT）的影响

3.3 CLDN6影响宫颈癌细胞侵袭的作用机制

3.3.1 CLDN6对宫颈癌细胞ERK信号通路的影响

3.3.2 ERK信号通路活化对宫颈癌细胞侵袭能力的影响

3.3.3 CLDN6通过AF-6 抑制ERK通路的活化影响细胞侵袭

3.4 宫颈癌组织中CLDN6、p-ERK与E-Cadherin表达

3.4.1 CLDN6在宫颈癌组织中的表达及其与临床指标的关系

3.4.2 宫颈癌组织中p-ERK的表达及其与CLDN6的相关性

3.4.3 宫颈癌组织中E-Cadherin表达与CLDN6表达的相关性

第四章讨论

4.1 序言

4.2 CLDN6调控宫颈癌细胞的侵袭表型

4.2.1 CLDN6调控宫颈癌细胞的紧密连接功能

4.2.2 CLDN6影响宫颈癌细胞侵袭迁移能力

4.2.3 CLDN6调控宫颈癌细胞EMT

4.3 CLDN6调控宫颈癌细胞侵袭的机制

4.4 宫颈癌组织中CLDN6、p-ERK与E-Cadherin表达

第五章结论

第六章论文创新性总结

参考文献

附表

作者简介及在学期间所取得的科研成果

致谢

【相似文献】