MUC4、MUC16在卵巢癌细胞系癌变机制及与卵巢癌临床病理特征关系研究

发布时间：2018-05-06 17:20

本文选题：卵巢癌 + 细胞系　；参考：《扬州大学》2014年博士论文

【摘要】：—. MUC4、MUC16在卵巢癌细胞系癌变机制研究背景与目的：卵巢癌是目前死亡率最高的妇科恶性肿瘤。70%的卵巢癌患者诊断时已达中晚期。卵巢癌被描绘为“沉默杀手”。标准的卵巢癌治疗是手术加联合化疗(铂-紫杉醇),大多数病人最初对化疗有反应,大约25%的患者对治疗无反应。对于经过标准治疗后的晚期患者大约只有60-80%反应率,最终卵巢癌复发,中期生存时间仅为18个月。因此,寻找新的早期诊断方法和治疗策略十分必要,才有可能提高晚期患者生存率。卵巢上皮癌(EOC)大约占所有卵巢肿瘤的90%,常直接播散到邻近器官。卵巢癌患者的生存期与早期诊断密切相关。5年生存率在工期大约90%,而Ⅲ-Ⅳ期卵巢癌一旦肿瘤播散到盆腔五年生存率大约是17-29%。卵巢癌难以及时和早期诊断的因素涉及到缺少特征性临床表现和早期诊断特异性标志物。目前阴道超声和血浆CA125水平是最常用的卵巢癌筛查方法。但临床应用这些方法监测早期卵巢上皮癌由于缺少特异性和敏感性,效果受到限制。卵巢上皮癌起源于卵巢上皮表面组织,黏蛋白(mucin,MUC)是有诊断价值的生物学标志物。克隆的CA125基因由于它的产物与粘蛋白家族蛋白类似被称之为MUC16。研究发现CA125(MUC16)的水平上升是诊断卵巢癌最常用标准。但近50%早期卵巢癌患者CA125水平未出现上升甚至部分卵巢癌晚期患者CA125水平也未上升,且CA125水平上升也见于其他癌症和良性病变。在卵巢癌患者为何CA125水平在早期、晚期只有部分升高甚至不升高目前尚不清楚其机制。用CA125 (MUC16)作为早期诊断卵巢癌标志物存在明显不足,寻找新的血浆标志物配合CA125有可能促进早期诊断。MUC4是黏蛋白家族的成员之一,在细胞黏附、运动、信号传导、组织再生和分化、肿瘤生长和转移中均起到重要作用。MUC4表达水平可反映患者肿瘤活跃状态,并成为判断肿瘤预后及是否早期转移的指标。本研究对卵巢癌SK0V3、0VAR3、CA0V3三种细胞系行细胞培养蛋白浓度测定,用半定量PCR、荧光定量PCR分析细胞MUC4、 MUC16mRNA水平,采用Western Blot、免疫细胞化学SABC法检测MUC4、MUC16蛋白表达水平,目的探索MUC4、MUC16基因在卵巢癌细胞系致癌机制、在RNA水平和蛋白水平表达,并揭示临床早期或晚期卵巢癌患者CA125水平正常或不上升机制。方法1、细胞培养人卵巢癌SKOV-3细胞、OVCAR-3细胞培养于高糖DMEM+10%胎牛血清+1ml青/链霉素的培养基中,人卵巢癌CAOV-3细胞培养于McCoy' 5A+10%胎牛血清+1ml青/链霉素的培养基中,三种细胞均置于37℃,5%C02培养箱中培养。2、总RNA的提取和RT-PCR检测应用RT-PCR技术,检测人卵巢癌SKOV-3细胞、OVCAR-3细胞、CAOV-3细胞中MUC4及MUC16 mRNA水平的表达,以GAPDH作为内参。提取细胞总RNA,以mRNA为模板,在逆转录酶的作用下逆转录合成cDNA,以cDNA为模板,用MUC4及MUC16相应引物特异性扩增相应基因。半定量RT-PCR产物,包括237bp (MUC4)和114bp (MUC16),用2%琼脂糖凝胶电泳进行半定量检测。实时荧光定量RT-PCR反应结束后分析扩增曲线和融解曲线,用Comparative Delta-delta Ct进行相对定量分析。3、细胞免疫荧光实验采用细胞免疫荧光检测人卵巢癌SKOV-3细胞、OVCAR-3细胞、CAOV-3细胞中MUC4及MUC16蛋白表达情况。将细胞均匀种植于铺有细胞爬片的24孔板中,培养箱中孵育24h,弃掉孔内培养液,PBS洗3遍,取出细胞爬片,4%多聚甲醛固定30min,3%H2O2灭活内源性过氧化物酶,封闭液37℃孵育1h,一抗4℃孵育过夜,然后用二抗37℃避光孵育1h,PI染核后封片,在荧光倒置显微镜下观察结果。4、免疫细胞化学SABC法细胞免疫化学SABC法与细胞免疫荧光法相似,可用于检测人卵巢癌SKOV-3细胞、OVCAR-3细胞、CAOV-3细胞中MUC4及MUC16蛋白表达情况。5、Westen Blot实验应用Westen Blot方法检测人卵巢癌SKOV-3细胞、OVCAR-3细胞、CAOV-3细胞中MUC4及MUC16蛋白表达水平,以β-actin作为内参。提取三种细胞样本的蛋白,制备蛋白样本,进行SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、封闭、抗体孵育、显色。结果1、RT-PCR检测结果显示：MUC4在人卵巢癌SKOV-3细胞、OVCAR-3细胞、CAOV-3细胞中表达量差异无统计学意义(P0.05)：MUC16 mRNA在人卵巢癌OVCAR-3细胞中表达量最高,CAOV-3细胞次之,SKOV-3细胞表达量最低,差异具有统计学意义(P0.05)。2、细胞免疫荧光法、免疫细胞化学法及Westen Blot法检测发现：MUC4蛋白在人卵巢癌SKOV-3细胞和OVCAR-3细胞中不表达,在CAOV-3细胞中有表达；MUC16蛋白在人卵巢癌SKOV-3细胞、OVCAR-3细胞、CAOV-3细胞中均有表达,并且在OVCAR-3细胞中表达最高,在CAOV-3细胞次之,在SKOV-3细胞中表达最低,差异具有统计学意义(P0.05)。结论1、人卵巢癌SKOV-3、OVCAR-3和CAOV-3三种细胞系中MUC4及MUC16在mRNA水平及蛋白水平表达情况各不相同,早期卵巢癌50%病人CA125(MUC16)水平正常、或晚期病人CA125(MUC16)水平不上升与CA125(MUC16)在不同类型卵巢癌不表达或低表达有关。2、MUC4及MUC16与卵巢癌的发生发展有密切的关系,MUC4可能单独或联合MUC16作为卵巢癌临床诊断的辅助实验室指标。二.MUC4、MUC16和NF-κB/p65在正常卵巢组织和卵巢肿瘤的表达及与卵巢癌临床病理关系研究背景和目的：卵巢癌是目前排列第二位的妇科恶性肿瘤,上皮性卵巢癌是最常见和广泛腹腔转移的卵巢癌,由于缺少特征临床症状和敏感的肿瘤标志物,通常在中晚期才被诊断,加上卵巢癌治疗过程中易产生耐药性,成为最致命的妇科恶性肿瘤。目前最常用的卵巢癌早期筛查方法包括血浆CA125水平检测、阴道超声检查。但临床应用这些方法监测早期卵巢上皮癌由于缺少特异性和敏感性效果受到限制。近50%早期卵巢癌患者CA125水平未出现上升,且CA125水平上升也见于其他癌症和良性病变。用CA125(MUC16)作为早期诊断卵巢癌标志物存在明显不足,寻找新的血浆标志物配合CA125有可能促进早期诊断。MUC4在不同类型肿瘤组织研究显示表达明显,且与MUC16联合检测能提高MUC16早期诊断价值,MUC4可能是较好的候选肿瘤标致物,此外,近期研究MUC4在卵巢癌腹腔扩散细胞出现高表达。NF-κB为一种家族转录基因,能调节超过400种基因,这些被调节的基因包括多种细胞因子、炎症前因子基因、附分子、凋亡基因和其他转录因子。NF-κB能促进卵巢细胞增生并与化疗抵抗有关。近来有研究结果发现黏附分子基因上主要区域和启动点位置存在NF-κB识别位点,NF-κB可促进一些黏蛋白启动子激活和基因表达,从而调节细胞黏附功能及转移发展。在卵巢癌发生和发展中,黏蛋白的表达与临床病理关系及NF-κB与黏蛋白共同影响卵巢癌的发生和发展报道较少。本实验采用免疫细胞化学SP法检测MUC4、MUC16和NF-κB/p65在正常卵巢组织和卵巢上皮性肿瘤中的表达,分析这些基因的表达与卵巢癌临床病理相关性,为卵巢癌的早期诊断、预后判断寻找标志物及提供理论依据。方法：采用免疫细胞化学SP法,检测MUC4、MUC16和NF-κB/p65在10例正常卵巢组织、20例卵巢良性上皮性肿瘤,10例卵巢交界性上皮性肿瘤,40例卵巢恶性上皮性肿瘤中的表达及与临床病理关系：研究对象入院后在空腹情况下抽取肘静脉血2ml,分离血清用于CA125检测。结果：(1).MUC4、MUC16、NF-κB/p65在正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤和卵巢癌阳性表达程度不同：MUC4在正常卵巢组织、良性肿瘤、交界性肿瘤和卵巢癌阳性表达率分别为0、10%(2/20)、40%(4/10)、90%(36/40)；MUC16分别为为10%(1/10)、20%(4/20)、60%(6/10)和87.5%(27/52)；NF-κB/p65分别为10%(1/10)、20%(4/20)、60.0%(6/10)和85.0%(34/40)。(2)MUC4、MUC16、NF-κB/p65在卵巢癌不同亚型表达情况：MUC4在浆液性卵巢癌、粘液性卵巢癌和其他类型卵巢上皮癌阳性表达率分别为86.36%(19/22)、75%(8/12)和50%(3/6),浆液性和粘液性两组差异不显著(p0.05)。MUC16阳性表达率分别为81.81%(18/22)、25%(3/12)和50%(3/6),浆液性和粘液性两组异显著(p(0.05)。NF-κB/p65阳性表达率分别为86.36%(19/22)、33.33%(4/12)和33.33%(2/6),浆液性和粘液性两组差异显著(p0.05)。在浆液性卵巢癌MUC4、MUC16和NF-κB/p65都出现较高的阳性表达率,在粘液性卵巢癌MUC4的阳性表达率明显高于MUG16和NF-κB/p65,差异有显著性(p0.05)。(3)MUC4、MUC16、NF-κB/p65卵巢癌表达情况与临床期别关系：MUC4在Ⅰ-Ⅱ期和Ⅲ-Ⅳ期卵巢癌阳性表达率分别为91.67%(11/12)和75%(21/28),两组相比差异显著(p0.05)。MUC16分别为50%(6/12)和85.7%(24/28),两组相比较差异显著(p0.05)。NF-κB/p65分别为58.33%(7/12),82.14%(23/28),两组相比差异显著(p0.05)。MUC4在早期卵巢癌表达明显高于MUC16和NF-κB/p65,而在晚期卵巢癌三个标志物表达无明显差异。(4)MUC4、MUC16、NF-κB/p65卵巢癌表达情况与预后意义关系：MUC4在有卵巢癌淋巴结转移组和无淋巴结转移组阳性表达率分别为66.67%(8/12)和57.14%(16/28),两者无显著差异(p0.05)。MUC16分别为83.33%(10/12)和71.42%(20/28),两组差异显著(p0.05)。NF-κB/p65分别为为66.67%(8/12)和57.14%(16/24),两组无显著差异(p0.05)。MUC4在高分化和中低分化卵巢癌组阳性表达率分别为77.77%(7/9)和58.06%(18/31),两者差异显著(p0.05)。MUC16分别为33.33%(3/9)和83.87%(26/31),两者差异显著(p0.05).NF-κB/p65分别为55.55%(5/9)和77.42%(24/31),两组差异显著(p0.05)。在血清CA125值升高组卵巢癌和血清CA125值正常组MUC4阳性表达率分别为76.19%(16/21)和84.21%(16/19),两组相比差异不显著(p0.05)。MUC16阳性表达率分别为85.71%(18/21)和42.10%(8/19),两组相比差异显著(p0.05)。NF-κB/p65阳性表达率分别为85.71%(18/21)和78.94%(15/19),相比差异不显著(p0.05)。(5)MUC4和MUC16在卵巢癌中的表达率和表达程度相互比较,结果MUC4的表达率和表达强度高于MUC16,差异显著(P0.05),(6)MUC4、MUC16和NF-κB/p65相关性比较：MUC4与NF-κB/p65呈正相关(r=0.69,p0.01)； MUC16与NF-κB/p65呈正相关(r=0.58,p0.01)。结论： (1)MUC4、MUC16和NF-κB/p65在卵巢癌出现过度表达。MUC4、MUC16和NF-κB/p65与卵巢癌的发生发展有关；MUC4在早期卵巢癌表达明显,MUC16过度表达伴有淋巴结转移可能与预后不良有关；MUC4单独或联合MUC16检测可能是有效的标志物用于卵巢癌的早期诊断和晚期预后判断。(2)在粘液性卵巢癌MUC4的阳性表达率明显高于MUC16和NF-κB/p65,MUC4可用于临床粘液性卵巢癌诊断和鉴别诊断：(3)MUC4、MUC16和NF-κB/p65表达相关性研究,结果提示黏蛋白与NF-κB/p65表达相关性较好,黏蛋白的表达可能受NF-κB/p65的调控。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.31

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