ATF3在子宫内膜浆液性癌中的表达及对SPEC-2细胞体外增殖的影响

发布时间：2018-05-08 11:00

本文选题：子宫内膜癌 + 浆液性癌　；参考：《山东大学》2015年博士论文

【摘要】：背景子宫内膜癌是子宫内膜上皮来源的恶性肿瘤,属于女性生殖道三大恶性肿瘤之一,好发于老年妇女。随着人口老龄化、饮食结构和生活方式的改善,其发病率及死亡率在全球范围内呈现上升趋势,且发病年龄趋于年轻化。在欧美国家,子宫内膜癌发病率位于妇科恶性肿瘤首位,在我国位居第二位,但是近年来在北京、上海等发达城市其发病率已超过宫颈癌而位居妇科恶性肿瘤首位。其中浆液性癌是子宫内膜癌中恶性程度较高的一种病理类型,而关于子宫内膜浆液性癌的大宗病例研究少见报道。系统掌握子宫内膜浆液性癌的临床病理学特征、诊断及鉴别诊断,提高对此肿瘤生物学行为的认识,对于妇科、肿瘤科及病理科医师具有重要意义。目的探讨子宫内膜浆液性癌临床病理学特征、诊断、鉴别诊断及预后,进一步提高对该肿瘤的认识。方法回顾性分析烟台毓璜顶医院2005年1月至2013年12月期间确诊为子宫内膜浆液性癌患者的临床病理资料,患者均接受广泛子宫及双侧附件切除术加盆腔淋巴结清扫,术前均未做任何治疗,术后经组织病理学诊断为子宫内膜浆液性癌。对肿瘤组织进行雌激素受体、孕激素受体、突变型P53的免疫组织化学染色,统计分析雌激素受体、孕激素受体、突变型P53表达与临床病理学参数及预后情况的关系。计数资料采用x2检验,P0.05为差异具有统计学意义。结果1.本组33例子宫内膜浆液性癌占同期子宫内膜癌的比例为5.02%(33/672)。患者发病年龄44-73岁,中位年龄64岁。93.94%患者为绝经后女性(31/33)。肿瘤最大直径1-12cm,平均直径3.87cm。影像学检查以宫腔内占位多见(16/33,48.48%),其次表现为内膜不规则增厚(10/33,30.3%),仅少数患者表现为宫腔积液(7/33,21.21%)。临床症状多表现为绝经后阴道流血或流液(29/33,87.88%),3例患者表现为下腹疼痛或不适(3/33,9.09%),1例表现为外阴脱出肿物伴排尿困难(1/33,3.03%)。14例发生淋巴结转移(14/33,42.42%)；19例患者肿瘤浸润深度1/2肌层(19/33,57.58%)；15例临床分期Ⅰ-Ⅱ期(15/33,45.45%),18例Ⅲ-Ⅳ期(18/33,54.55%)。其中浸润深度1/2肌层的19例患者中有7例患者出现淋巴结转移(7/19,36.84%)。本组33例患者均获得随访,随访时间2-64个月,平均26.67个月,其中16例(16/33,48.48%)存活,17例(17/33,51.52%)患者死于本病。2.本组病例共同的组织学特点是肿瘤细胞呈复杂分支状的乳头结构、实性巢状或腺管状排列,乳头结构中央为纤维脉管轴心；肿瘤细胞体积大,边界不清,胞浆嗜酸性或粉染,核大小不一、形态不规则,扭曲分叶,染色质粗颗粒状,核仁显著嗜酸性,核分裂相易见。18例患者(18/33,54.54%)肿瘤组织内可见坏死；7例患者(7/33,24.24%)肿瘤组织内见砂粒体形成。3.子宫内膜浆液性癌中雌激素受体、孕激素受体及突变型P53阳性信号均定位于肿瘤细胞的细胞核。本组病例中27例患者雌激素受体、孕激素受体均为阴性表达(27/33,81.82%),2例(2/33,6.06%)雌激素受体(+)、孕激素受体(+),3例(3/33,9.09%)呈雌激素受体(-)、孕激素受体(+)表达模式,1例(1/33,3.03%)雌激素受体(+)、孕激素受体(-)表达；突变型P53免疫组化染色显示24例(24/33,72.73%)为阳性表达,9例为阴性表达(9/33,27.27%)。雌激素受体、孕激素受体、突变型P53表达差异与患者年龄、肿瘤大小、浸润深度、临床分期及淋巴结转移均无统计学意义(P0.05)。4.在年龄、肿瘤大小、浸润深度、临床分期及淋巴结转移等因素中,仅淋巴结转移组中患者无病生存率具有显著差异(P0.05)结论1.子宫内膜浆液性癌是一类少见的子宫内膜癌,以老年女性多见。绝经后阴道流血是常见的临床症状,影像学检查多表现为宫腔内息肉或占位。2.子宫内膜浆液性癌需要与低分化子宫内膜样腺癌、卵巢浆液性癌子宫内膜转移等多种恶性肿瘤鉴别,免疫组织化学染色具有一定帮助。3.子宫内膜浆液性癌为非激素依赖性肿瘤；p53基因突变与子宫内膜浆液性癌发生关系密切。4.子宫内膜浆液性癌生物学行为特殊,早期可发生淋巴结转移；患者预后差,淋巴结转移是预后不良因素。背景子宫内膜浆液性癌恶性程度高,死亡率占全部子宫内膜癌的50%,但子宫内膜浆液性癌确切的病因及发病机制尚不清楚,至今尚无针对性的治疗方法。基于上述情况,深入探讨子宫内膜浆液性癌的发病机制,寻找新的治疗靶点及切实有效的治疗方法,意义重大。子宫内膜浆液性癌的发生与p53基因突变密切相关。p53基因定位于人类第17号染色体短臂,编码393个氨基酸,根据氨基酸组成分为野生型和突变型。野生型P53是一种转录因子,含有一段具有转录活性的氨基酸残基,通过与特异性DNA序列(P53应答元件)结合激活下游相关基因参与DNA修复、细胞周期调节以及诱导细胞凋亡。突变型P53与近乎一半的恶性肿瘤发生存在密切关系,其促进肿瘤发生存在三种机制：①突变型P53丧失了野生型P53具有的与P53应答元件结合的能力,失去了正常的抑癌作用；②突变型P53与野生型P53结合形成异四聚体,抑制后者作为转录因子的活性；③突变型P53获得了一种新的致癌功能,促进细胞恶性转化。近年来研究发现多种调节蛋白可以通过影响突变型P53蛋白的空间构象以及促进蛋白降解等途径调控突变型P53的功能,进而显示出抑制肿瘤形成及转移的作用。因此,新型突变型P53调控蛋白的寻找,对于明确子宫内膜浆液性癌的发生机制以及寻找新型治疗靶点具有重要科学意义。激活转录因子3属于含亮氨酸拉链结构的转录因子ATF/CREB家族成员。该基因有A、B、C、E四个外显子,编码181个氨基酸,其中A区为非编码区,B区编码N端80个氨基酸,C区编码36个氨基酸,E区编码大部分为Zip结构的65个氨基酸及3’非翻译区。激活转录因子3可以被一系列应激信号快速诱导表达,广泛参与内环境稳定、细胞黏附、创伤愈合、细胞凋亡等生理和病理过程,Yuan等发现激活转录因子3通过调节细胞骨架重建抑制膀胱癌转移。Hackl等通过siRNA敲除大肠癌细胞激活转录因子3基因,在体外增加了肿瘤的转移,在异体移植模型中促进了肿瘤的生长以及向肝脏转移的能力。Liu等报道激活转录因子3通过上调死亡受体5的表达促进肿瘤细胞凋亡。另有研究显示激活转录因子3在多种人类肿瘤组织如肺癌、乳腺癌、结肠癌及肝癌中表达显著降低,说明激活转录因子3在肿瘤发生及发展过程中扮演重要角色。研究发现激活转录因子3是野生型P53的重要调控因子。Yan C等报道激活转录因子3通过与野生型P53蛋白直接结合阻断野生型P53的泛素化降解途径。WangH等报道在HPV阳性的宫颈癌细胞内,激活转录因子3能够抑制人乳头状瘤病毒HPV-E6介导的野生型P53降解途经,并增强p53的转录活性,诱导下游基因p21表达,引起癌细胞凋亡。其作用机制可能为激活转录因子3与野生型P53结合引起后者空间构象改变,使其更易于结合DNA序列或其他转录活化因子；或者激活转录因子3直接竞争性结合p53基因启动子序列,增强p53转录活性。近期研究发现激活转录因子3能够直接结合突变型P53进而抑制突变型p53的癌基因功能。迄今为止,激活转录因子3与子宫内膜浆液性癌的关系尚不清楚。通过研究ATF3在子宫内膜浆液性癌中的表达规律,有望为浆液性癌治疗靶点的寻找奠定实验基础。目的探讨激活转录因子3在子宫内膜浆液性癌中的表达规律、与临床病理学参数的关系以及与突变型P53表达的相关性,为进一步研究激活转录因子3作为子宫内膜浆液性癌治疗靶点奠定实验基础。方法研究对象为烟台毓璜顶医院2005年1月至2013年12月期间入院接受手术治疗的33例子宫内膜浆液性癌患者。患者均接受广泛子宫及双侧附件切除术加盆腔淋巴结清扫,术前均未做任何治疗,术后经组织病理学诊断为子宫内膜浆液性癌。每例患者肿瘤周边正常子宫内膜组织作为对照。采用免疫组织化学EnVision染色法对上述33例子宫内膜浆液性癌及肿瘤周边正常子宫内膜组织进行激活转录因子3、雌激素受体、孕激素受体及突变型P53染色,比较激活转录因子3与子宫内膜浆液性癌临床病理特征及预后的关系,计数资料之间的比较采用x2检验；Spearman秩相关检验进行相关性统计学分析；采用Kaplan-Meier法计算生存率、绘制生存曲线,行Log-Rank检验分析。P0.05为差异具有统计学意义。结果1.激活转录因子3定位于细胞胞浆。激活转录因子3在癌旁子宫内膜组织中阳性比例是87.88%(29/33),33例浆液性癌组织中激活转录因子3阳性表达率为27.27%(9/33),经统计学分析,二者之间有显著差异(P0.01)。2.激活转录因子3在浆液性癌患者中的阳性表达率为：年龄≥64岁组为17.65%(3/17),64岁组为37.5%(6/16),经统计学检验分析两组之间差异无统计学意义(P=0.141)；在肿瘤最大直径≥3.87cm组中,激活转录因子3表达阳性率为25%(4/16),而在肿瘤最大径3.87cm组中,激活转录因子3表达率为29.41%(5/17),经统计学分析,两组之间阳性表达率无统计学意义(P=0.292)；在临床分期Ⅰ、¨期组中,激活转录因子3阳性表达率为33.33%(5/15),Ⅲ、Ⅳ期组中,激活转录因子3阳性率为22.22%(4/18),二者比较无统计学意义(P=0.238)；在浸润深度1/2肌层组中,激活转录因子3阳性表达率为26.32%(5/19),浸润深度≥1/2肌层组中,阳性率为28.57%(4/14),二者比较无统计学意义(P=0.302)；在淋巴结转移组中,激活转录因子3阳性表达率为14.29%(2/14),无淋巴结转移组中,激活转录因子3阳性率为36.84%(7/19),二者比较无统计学意义(P=0.119)。3.经Spearman秩相关检验子宫内膜浆液性癌组织中激活转录因子3表达与雌激素受体、孕激素受体表达无相关性(P0.05)；与突变型P53表达显著负相关(r=-0.542,P=0.001)。4.本组33例患者均获得随访,随访时间2-64个月,平均26.67个月,其中16例存活,17例患者死于本病。激活转录因子3阳性患者3年及5年无病生存率为100%及66.7%,而激活转录因子3阴性表达的患者中3年及5年无病生存率为25.9%及0。经统计学分析,激活转录因子3阳性表达患者预后显著好于激活转录因子3阴性表达患者(P0.01)。结论1.激活转录因子3在子宫内膜浆液性癌中表达显著降低。2.激活转录因子3表达与突变型P53表达呈负相关,可能参与浆液性癌发生过程中的重要步骤。3.激活转录因子3可作为子宫内膜浆液性癌患者的预后指标。背景子宫内膜浆液性癌是具有特殊生物学行为的子宫内膜癌病理类型,其恶性程度高,死亡率占全部子宫内膜癌的50%,目前仍无有效的治疗方法。第二部分实验结果提示在子宫内膜浆液性癌组织中激活转录因子3呈低表达状态；激活转录因子3表达与突变型P53表达呈显著负相关。本部分实验拟采用病毒载体上调浆液性癌SPEC-2细胞内激活转录因子3的表达水平,通过细胞学实验研究激活转录因子3对SPEC-2细胞体外增殖的影响,并开展相应的分子机制研究,为深入研究子宫内膜浆液性癌的发病机制,寻找可能的靶向治疗方法奠定分子生物学基础。目的探讨激活转录因子3对子宫内膜浆液性癌SPEC-2细胞体外增殖的影响及其可能的分子机制。方法1.细胞培养与病毒载体转染细胞：采用pBabe-ATF3/pBabe-puro以及p-SIH-shATF3/p-SIH-shLuc病毒载体。分别使用Ampho-293及HEK-293Fast细胞进行病毒制备,采用Polybrene作为感染增效剂感染SPEC-2细胞。Western Blot实验验证转染是否成功。2.MTT法检测细胞增殖情况：实验分阴性对照组、空白对照组和转染组。培养的不同时间点,在酶联免疫检测仪波长490nm处检测各组细胞的吸光光度值。转染组与对照组每孔重复检测3次,求平均值,绘制细胞生长曲线。3. Western Blot实验检测各组细胞中激活转录因子3、突变型P53、P21、细胞周期蛋白D1的蛋白表达情况。结果1.阴性对照组和空白对照组中,SPEC-2细胞表达一定量的激活转录因子3,而转染组细胞中激活转录因子3的蛋白水平显著升高(P0.05)。2.MTT比色实验结果显示：与阴性对照组和空白对照组相比,激活转录因子3表达上调后,SPEC-2细胞体外生长能力显著降低。随体外培养时间的延长,细胞体外生长受到抑制的程度不断增大。3.在各组细胞体外培养48小时后,对突变型P53、P21以及细胞周期蛋白D1的表达进行Western Blot分析。实验结果发现由于激活转录因子3表达上调,P21表达水平升高,而细胞周期蛋白Dl和突变型P53的表达有不同程度下降(P0.05)。结论1.高表达激活转录因子3对子宫内膜浆液性癌SPEC-2细胞体外增殖具有抑制作用。2.高表达激活转录因子3的子宫内膜浆液性癌SPEC-2细胞中P21表达上调、突变型P53和CyclinDl表达降低,可能是细胞体外增殖受到抑制的分子机制。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.33

【参考文献】