HIF-1a及其调控因子PHD2、VHL在子宫内膜异位症中的表达及补肾温阳化瘀方对其影响

发布时间：2018-05-25 10:21

本文选题：缺氧诱导因子-1a + 脯氨酸羟化酶　；参考：《河北医科大学》2015年博士论文

【摘要】：子宫内膜异位症是临床常见病、多发病,严重影响了患者的生活质量,其虽是良性病变,但有恶性肿瘤的生物学行为,目前子宫内膜异位症的发病机制尚不清楚。课题组前期研究表明:HIF-1a(缺氧诱导因子-1a)在子宫内膜异位症中表达升高,证实子宫内膜异位症存在乏氧状态。国内外学者通过对HIF-1a与恶性肿瘤的生物表达学特性之间的关系研究,发现其表达调控途径有VHL肿瘤抑制蛋白途径、MAPK途径、PI3K途径、RACK1途径。因HIF-1a在子宫内膜异位症的表达增强,HIF-1a表明不被降解。而在常氧条件下的调控途径是VHL肿瘤抑制蛋白途径;PHD(脯氨酸羟化酶)是一种氧传感器,是HIF-1a降解的关键限速酶,研究发现VHL蛋白能识别并结合564位脯氨酸被羟化的HIF-1a,而脯氨酸羟化酶PHD2能特异性羟化HIF-1a氧依赖降解结构中Pro-564,鉴于以上研究,我们分析因子宫内膜异位症存在乏氧状态,在乏氧条件下,PHD不能被活化,不能从蛋白质含量和转录活性两个方面介导HIF-1a,HIF-1a不能被降解;同样在乏氧条件下,VHL(希佩尔林道抑癌基因)不能识别HIF-1a亚基致其不被降解而活性增强。那么在子宫内膜异位症中PHD2、VHL如何调控HIF-1a及相互间的关系研究尚未见报道。既然子宫内膜异位症存在乏氧状态,那么深入研究其乏氧调控可以进一步明确其发病机制。本实验对明确内异症的发病机制有重要意义。目前其缺乏有效的治疗,前期的临床及动物实验证实补肾温阳化瘀方治疗子宫内膜异位症疗效确定,那么该方是否通过影响VHL基因蛋白及PHD2羟化酶而起到治疗子宫内膜异位症的作用,其作用机制值得进一步研究。目的:通过临床研究HIF-1a及其调控因子PHD2、VHL在子宫内膜异位症在位内膜、异位组织中的表达,探讨PHD2、VHL与子宫内膜异位症发病的关系;观察补肾温阳化瘀方对肾阳虚血瘀证子宫内膜异位症模型大鼠HIF-1a、PHD2、VHL表达的影响,研究补肾温阳化瘀方治疗子宫内膜异位症的作用机制。方法:1 HIF-1a及其调控因子PHD2、VHL在子宫内膜异位症中的表达实验组:选取2013年9月至2014年8月在河北省中医院、河北省医科大学第二医院、石家庄市六院患子宫内膜异位症而行腹腔镜或开腹手术治疗的患者20例,术中留取同一患者的在位内膜和异位内膜新鲜组织(患者签署知情同意书),术后经病理诊断证实为子宫内膜组织。术前3个月未用过激素治疗,年龄26-39岁,平均34.0±3.77岁。对照组:收集同期因子宫肌瘤行全子宫切除术患者的子宫肌瘤及正常子宫内膜组织作为对照组,且术后经病理证实为子宫肌瘤及正常子宫内膜组织。患者年龄30-40岁,平均年龄:35.1±3.87岁。两组患者年龄分布均衡,差异无统计学意义,具有可比性。采用免疫组织化学、蛋白免疫印迹(Western-blot)检测异位内膜、在位内膜、子宫肌瘤、正常组织中HIF-1a、PHD2、VHL蛋白的表达,RT-PCR方法检测HIF-1a m RNA、PHD2 m RNA、VHL m RNA的表达。2肾阳虚血瘀证子宫内膜异位症大鼠模型的建立模拟妇科“冒雨涉水,感受寒邪”的病因,依据“寒邪伤阳”的中医学理论,结合传统的“自体移植”子宫内膜异位症动物模型,以建立病证结合的“肾阳虚血瘀证”子宫内膜异位症动物模型。依据冷冻时间长短及前后顺序行3种不同的方法造模,方法如下:冷冻1个月,行子宫内膜异位症造模,再冷冻1个月设为“冷冻+造模+冷冻”组;冷冻1个月,行子宫内膜异位症造模后不冷冻为“冷冻+造模”组;先不冷冻,行子宫内膜异位症造模后,继续冷冻1个月,设为“造模+冷冻”组,另设空白对照组。用大鼠宏观表现及理化检验指标评价该模型的临床符合度。3补肾温阳化瘀方对肾阳虚血瘀证子宫内膜异位症模型大鼠HIF-1a、PHD2、VHL表达的影响将50只SD大鼠分为空白对照组(简称对照组)、假手术组、模型组、中药组、西药组,每组10只。其中对照组、假手术组常规饲养,模型组、中药组、西药组采用“延长冰箱冷冻加冰水浸泡”30天,再结合“自体移植法”创建内异症肾阳虚血瘀证模型,术后给予中药组补肾温阳化瘀方、西药组孕三烯酮灌胃,模型组、对照组、假手术组灌服等体积的生理盐水,造模4周后观察大鼠异位灶大小及形态,HE染色光镜观察子宫在位内膜及异位组织形态学的变化,免疫组化SABC法、Western blotting检测HIF-1a、PHD2、VHL蛋白,RT-PCR方法检测HIF-1a m RNA、PHD2m RNA、VHL m RNA表达。结果:1 HIF-1a、PHD2、VHL在子宫内膜异位症中的表达1.1免疫组化法检测异位内膜、在位内膜、子宫肌瘤、正常子宫内膜组织中HIF-1a、PHD2、VHL蛋白的表达结果1.1.1 HIF-1a的表达HIF-1a的阳性表达呈棕黄色颗粒状,在异位组织中细胞排列紊乱,上皮细胞染色浅,腺体上皮细胞变薄;在位组腺体相对清晰,阳性细胞染色较深,子宫肌瘤组织中细胞排列紊乱,无完整腺体,结构模糊,细胞收缩、坏死,阳性细胞表达浅。在正常子宫内膜组腺体完整,阳性细胞染色浅。以平均光密度值表达,值越大表明含量越高。HIF-1a在各组表达由高到低的顺序:异位内膜组、在位内膜组、子宫肌瘤组、正常子宫内膜组。异位内膜HIF-1a的表达增强,与子宫肌瘤、在位内膜、正常内膜组比较差异有统计学意义(P0.05);在位内膜组与子宫肌瘤、正常内膜组比较有统计学意义(P0.05),子宫肌瘤组与正常内膜组比较差异有统计学意义(P0.05)。1.1.2 PHD2的表达PHD2的阳性表达呈棕黄色颗粒。异位内膜组腺体完整,阳性细胞表达浅;在位内膜组腺体完整,上皮细胞薄,阳性细胞表达浅;子宫肌瘤组无完整腺体,阳性细胞表达深;正常内膜组:腺体完整,细胞排列紧密,阳性细胞染色深。PHD2在各组表达由高到低的顺序是:正常内膜组、子宫肌瘤组、在位内膜组、异位内膜组。PHD2在正常内膜组的表达与子宫肌瘤组、在位内膜组、异位内膜组相比有统计学意义(P0.05);子宫肌瘤组与在位、异位内膜组表达比较有统计学意义(P0.05);在位内膜组、异位内膜组表达差异比较有统计学意义(P0.05)。1.1.3 VHL的表达VHL阳性表达呈棕黄色颗粒。异位内膜组表现为腺体不完整,阳性细胞染色浅;在位内膜组:腺体较完整,细胞染色浅;子宫肌瘤组:腺体不完整,上皮细胞薄,呈扁平状,阳性细胞染色较深;正常内膜组:腺体完整,上皮细胞呈柱状,结缔组织中有少量表达,阳性细胞在游离端表达最深。VHL在各组表达由高到低的顺序是:正常子宫内膜组、子宫肌瘤组、在位内膜组、异位内膜组。VHL在正常子宫内膜组的表达与子宫肌瘤组、在位内膜组、异位内膜组相比有统计学意义(P0.05);子宫肌瘤组与在位内膜组、异位内膜组表达比较有统计学意义(P0.05);在位内膜组、异位内膜组表达比较有统计学意义(P0.05)。1.2 Western-blot检测异位、在位内膜、子宫肌瘤、正常内膜组织中HIF-1a、PHD2、VHL蛋白的表达结果1.2.1 HIF-1a蛋白的表达结果显示:HIF-1a蛋白在各组表达由高到低的顺序是:异位内膜组、在位内膜组、子宫肌瘤组、正常内膜组。异位内膜组与在位内膜组、子宫肌瘤组、正常内膜组的表达差异均有统计学意义(P0.05);在位内膜组与子宫肌瘤组比较无统计学意义(P0.05),与正常内膜组比较差异有统计学意义(P0.05);子宫肌瘤组与正常内膜组比较其差异有统计学意义(P0.05)。1.2.2 PHD2蛋白的表达统计结果显示:PHD2蛋白在各组表达由高到低的顺序是:正常内膜组、子宫肌瘤组、在位内膜组、异位内膜组。正常内膜组与异位内膜组、在位内膜组表达比较差异均有统计学意义(P0.05),与子宫肌瘤组比较差异无统计学意义(P0.05);子宫肌瘤组与在位内膜组、异位内膜比较其差异有统计学意义(P0.05);在位内膜组与异位内膜组比较差异有统计学意义(P0.05)。1.2.3 VHL蛋白的表达统计结果显示:VHL蛋白在各组表达由高到低的顺序是:正常内膜组、子宫肌瘤组、在位内膜组、异位内膜组。正常内膜组与异位内膜组、在位内膜组、子宫肌瘤组比较差异均有统计学意义(P0.05);子宫肌瘤组与异位内膜组、在位内膜组比较差异有统计学意义(P0.05);异位内膜组、在位内膜组比较差异无统计学意义(P0.05)。1.3 RT-PCR检测在位内膜和异位灶组织HIF-1a mRNA、PHD2 mRNA、VHL m RNA表达1.3.1 HIF-1a m RNA的表达统计学结果显示:HIF-1a m RNA在各组表达由高到低的顺序是:异位内膜组、在位内膜组、子宫肌瘤组、正常内膜组。异位内膜组HIF-1a的表达增强,与在位内膜组、子宫肌瘤组、正常内膜组相比较差异均有统计学意义(P0.05);在位内膜组与子宫肌瘤组、正常内膜组比较差异有统计学意义(P0.05),子宫肌瘤组与正常子宫内膜组比较差异有统计学意义(P0.05)。1.3.2 PHD2 mRNA的表达统计结果显示:异位内膜组PHD2 m RNA的表达由高到低的顺序是:正常内膜组、子宫肌瘤组、在位内膜组、异位内膜组。异位内膜组与正常内膜组比较有统计学意义(P0.05),与在位内膜组、子宫肌瘤组比较差异无统计学意义(P0.05);在位内膜组与正常内膜组比较差异有统计学意义(P0.05),与子宫肌瘤组比较差异无统计学意义(P0.05);子宫肌瘤组与正常内膜组比较差异有统计学意义(P0.05)。1.3.3 VHL m RNA的表达统计结果显示:异位内膜组VHL mRNA的表达由高到低的顺序是:正常内膜组、子宫肌瘤组、在位内膜组、异位内膜组。异位内膜组与在位内膜组、子宫肌瘤组、正常内膜组比较,其差异均有统计学意义(P0.05);在位内膜组与子宫肌瘤组及正常内膜组比较差异有统计学意义(P0.05),子宫肌瘤组与正常内膜组相比有统计学意义(P0.05)。1.4 HIF-1a与PHD2、VHL表达的相关性结果显示:HIF-1a与PHD2呈负相关,相关系数为-0.908;HIF-1a与VHL呈负相关,相关系数为-0.875。2肾阳虚血瘀证子宫内膜异位症大鼠模型的建立2.1大鼠一般情况实验观察对照组大鼠的毛色白且有光泽、精神佳、活泼、反应灵敏,饮食、二便均正常。冷造冷组、冷造、造冷组大鼠出现身脏毛污,反应迟钝,蜷缩懒动,后肢行动迟缓、寒战,扎堆怕冷、爪尾部苍白,尾部皮下瘀紫、耳色苍白,呼吸微弱,被毛无光泽,饮水量少,大便稀溏等。冷造冷组大鼠表现更为明显。2.2盆腔异位灶观察肉眼见冷造冷组移植物生长良好,体积明显增大,呈隆起暗红色或透亮的小囊状,内部充满积液,表面血管清晰可见,异位组织周围血管丰富,有些异位组织与周围组织粘连;冷造及造冷组移植物体积较小,表面血管细,异位组织周围血流差。2.3各组大鼠体温情况冷冻1个月后,冷造冷组、冷造组大鼠体温较造冷组及对照组大鼠体温降低,统计处理后,冷造冷组大鼠体温与造冷组、对照组大鼠比较其差异均有统计学意义(P0.05),与冷造组差异无统计学意义(P0.05),造冷组与对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。冷冻2个月后,冷造冷组与冷造组、空白对照组比较有统计学意义(P0.05),冷造冷组与造冷组大鼠体温比较无统计学意义(P0.05),冷造组与对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。2.4各组大鼠体重情况冷冻1个月后,各组大鼠体重有所增加,但冷造冷组、冷造组较造冷组、对照组比较体重上升缓慢,经统计学处理后,冷造冷组与造冷组、对照组比较其差异均有统计学意义(P0.05),与冷造组比较其差异无统计学意义(P0.05)。造冷组与冷造组比较差异有统计学意义(P0.05),造冷组与正常组比较差异无统计学意义(P0.05);冷冻2个月后,冷造冷组与造冷组、冷造组、对照组差异有统计学意义(P0.05),造冷组与冷造组比较差异无统计学意义(P0.05)。2.5各组大鼠血清性激素水平比较各组大鼠的雌二醇、孕酮、睾酮水平由低到高的顺序是:冷造冷组、造冷组、冷造组、空白对照组,经统计学处理,冷造冷组雌二醇水平与其余各组比较其差异均有统计学意义(P0.05),造冷组、冷造组比较其差异无统计学意义(P0.05),冷造冷组、造冷组、冷造组、空白对照组间睾酮、孕酮水平两两比较其差异均有统计学意义(P0.05)。2.6各组大鼠血流变全血粘度、还原粘度的比较结果显示:各组大鼠全血粘度由高到低的顺序是:冷造冷组、造冷组、冷造组、对照组。全血粘度的低切、中切、高切比较,经统计学处理后,冷造冷组、造冷组、冷造组、对照组大鼠全血粘度的低切、中切及高切间两两比较后均有统计学意义(P0.05)。各组间还原粘度由高到低的顺序是:冷造冷组、造冷组、冷造组、对照组。还原低切两两比较差异有统计学意义(P0.05);冷造冷组与造冷组、空白对照组中切比较有统计学意义(P0.05),冷造冷组与冷造组比较差异无统计学意义(P0.05);冷造冷组与冷造组、对照组高切比较有统计学意义(P0.05),与造冷组比较无统计学意义(P0.05),造冷组与冷造组、对照组比较差异均有统计学意义(P0.05)。2.7大鼠脏器指数的比较各组大鼠的脾脏指数由低到高的顺序是冷造冷组、造冷组、冷造组、对照组。冷造冷组与造冷组、冷造组、对照组比较其差异均有统计学意义(P0.05),造冷组与对照组比较其差异有统计学意义(P0.05),与冷造组比较其差异无统计学意义(P0.05),冷造组、对照组比较差异无统计学意义(P0.05);冷造冷组大鼠胸腺指数低到高的顺序是冷造冷组、造冷组、冷造组、对照组。冷造冷组与造冷组、冷造组、空白对照组比较其差异均有统计学意义(P0.05),造冷组、冷造组、空白对照组两两比较差异无统计学意义(P0.05);大鼠的子宫指数由低到高的顺序是冷造冷组、造冷组、冷造组、对照组。冷造冷组与造冷组差异无统计学意义(P0.05),冷造冷组与冷造组、空白对照组其差异有统计学意义(P0.05),冷造组与对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。2.8各组大鼠血清CA125、c AMP、c GMP的影响结果显示,冷造冷组大鼠血清CA125、c GMP表达高于造冷组、冷造组、对照组,与各组比较其差异均有统计学意义(P0.05);造冷组表达高于冷造组、对照组,与冷造组比较差异无统计学意义(P0.05),与对照组比较差异有统计学意义(P0.05),冷造组的表达高于对照组,其差异有统计学意义(P0.05);冷造冷组大鼠血清c AMP表达低于其余各组,与其余各组比较其差异均有统计学意义(P0.05),冷造组、造冷组大鼠c AMP的表达均低于对照组,与对照组比较差异有统计学意义(P0.05),造冷组的表达高于冷造组,与其比较差异无统计学意义(P0.05)。3补肾温阳化瘀方对肾阳虚血瘀证子宫内膜异位症模型大鼠HIF-1a、PHD2、VHL表达的影响3.1大鼠一般情况对照组大鼠毛色白有光泽,精神佳,活泼,喜动,反应灵敏,饮食大便正常。假手术组大鼠较对照组大鼠毛色稍暗,精神可,较活泼,喜动,反应较灵敏,饮食大便正常。模型组大鼠身脏毛污,反应迟钝,蜷缩懒动,饮食量少,大便稀溏。中药组、西药组大鼠表现为身脏毛色较暗,反应较灵敏,活动可,饮食量稍少,大便成形。3.2异位灶形态学观察中药组、西药组、模型组均见移植物生长良好,体积明显增大,呈隆起暗红色或透亮的小囊状,内部充满积液,表面血管清晰可见,异位组织周围血管丰富,有些异位组织与腹腔脏器粘连。3.3 HE染色光镜观察结果显示,对照组子宫内膜规整,中膜内有腺腔、完整、排列整齐,细胞排列齐整;假手术组子宫内膜较对照组稍增厚,中膜内有腺腔,细胞排列紊乱;模型组内膜较假手术组内膜更厚,腺体不明显,管腔消失,细胞排列紊乱,炎性细胞增多,中药组管腔完整,但形态不规则,内膜排列整齐,中膜细胞排列不整齐;西药组子宫内膜不完整,腺腔不规则,中膜细胞收缩,细胞排列不整齐。3.4 SABC法检测子宫在位内膜、异位组织中PHD2、VHL、HIF-1a蛋白表达结果结果显示,HIF-1a阳性颗粒呈棕黄色,主要表达在子宫内膜、中膜、腺腔细胞核及胞浆中;PHD2主要表达在细胞膜上,胞浆少量表达;VHL阳性染色主要位于细胞核、细胞浆中。平均光密度反映指标的含量,值越大,反映指标的含量越高。结果显示,HIF-1a在各组表达由高到低的顺序是模型组、西药组、中药组、假手术组、对照组。模型组大鼠HIF-1a表达均高于对照组、假手术组(P0.05);中药组、西药组HIF-1a的表达均低于模型组(P0.05);PHD2、VHL在各组表达由高到低的顺序是对照组、假手术组、中药组、西药组、模型组。模型组PHD2、VHL的表达低于对照组、假手术组(P0.05),中药组、西药组表达均高于模型组,比较差异有统计学意义(P0.05)。3.5 Western blotting法检测子宫及异位灶组织中HIF-1a、PHD2、VHL蛋白表达结果结果显示,HIF-1a在各组表达由高到低的顺序是模型组、西药组、中药组、假手术组、对照组。模型组大鼠HIF-1a的表达高于对照组、假手术组,其差异有统计学意义(P0.05);HIF-1a在中药组、西药组的表达均低于模型组,其差异有统计学意义(P0.05),中药组、西药组比较无统计学意义(P0.05);PHD2在各组表达由高到低的顺序是对照组、假手术组、西药组、中药组、模型组。模型组PHD2的表达低于对照组、假手术组,其差异有统计学意义(P0.05)。中药组、西药组PHD2的表达较模型组增加,其差异有统计学意义(P0.05),西药组的表达高于中药组,其差异有统计学意义(P0.05);VHL在各组表达由高到低的顺序是:对照组、中药组、西药组、假手术组、模型组。模型组VHL的表达低于对照组、假手术组,其差异有统计学意义(P0.05);中药组、西药组VHL的表达高于模型组,其差异有统计学意义(P0.05),中药组、西药组间比较其差异无统计学意义(P0.05)。3.6各组大鼠子宫在位内膜和异位灶组织中HIF-1a m RNA、PHD2 m RNA、VHL m RNA的表达结果显示,HIF-1a m RNA在各组表达由高到低的顺序是模型组、中药组、西药组、假手术组、对照组。模型组大鼠HIF-1a m RNA的表达高于对照组、假手术组,其差异有统计学意义(P0.05),对照组与假手术组比较差异无统计学差异(P0.05)。模型组表达高于中药组、西药组,其差异有统计学意义(P0.05),中药组、西药组间比较无统计学意义(P0.05);PHD2 m RNA在各组表达由高到低的顺序是对照组、假手术组、西药组、中药组、模型组。模型组大鼠PHD2 m RNA表达较对照组、假手术组低,其差异有统计学意义(P0.05)对照组与假手术组比较差异无统计学差异(P0.05);模型组表达低于中药组、西药组,其差异有统计学意义(P0.05),中药组、西药组比较无统计学意义(P0.05)。VHL m RNA在各组表达由高到低的顺序是对照组、假手术组、西药组、中药组、模型组。模型组大鼠VHL m RNA表达低于对照组、假手术组,其差异有统计学意义(P0.05),模型组表达较中药组、西药组低,其差异有统计学意义(P0.05),中药组、西药组比较差异无统计学意义(P0.05)。3.7 HIF-1a与PHD2、VHL表达的相关性结果表明,HIF-1a与PHD2呈负相关(相关系数-0.799,p=0.00),HIF-1a与VHL呈负相关(相关系数-0.625,p=0.003)。结论:1临床研究表明,HIF-1a在子宫内膜异位症患者的异位组织中表达增强,PHD2、VHL蛋白在子宫异位内膜组织中表达降低,证实子宫内膜异位症存在乏氧状态。通过相关性研究表明,HIF-1a与PHD2、VHL均呈负相关,表明在乏氧条件下,PHD2不被活化,VHL不能识别HIF-1a亚基,致HIF-1a的表达增强,提示HIF-1a、PHD2、VHL在子宫内膜异位症的发病过程中起重要作用。2从大鼠的一般情况、盆腔异位病灶观察、血清孕酮、睾酮、雌二醇、血流变等指标及大鼠体温、体重等情况进行评估,“冷冻1个月-行子宫内膜异位症造模-再冷冻1个月”的“冷造冷组”实验大鼠模型最符合肾阳虚血瘀证子宫内膜异位症临床特征。可作为肾阳虚血瘀证子宫内膜异位症的动物模型。3补肾温阳化瘀方可以降低肾阳虚血瘀证子宫内膜异位症模型大鼠异位灶中HIF-1a的表达,改善子宫内膜异位症的乏氧状态,使脯氨酸羟化酶PHD2的活性增强,进一步介导HIF-1a的降解;同时VHL与HIF-1a亚基结合而使后者蛋白化而被降解,从而使HIF-1a的表达降低,PHD2、VHL的表达升高,起到治疗肾阳虚血瘀证子宫内膜异位症的作用。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R711.71

【参考文献】