MiR-101下调c-Fos蛋白对宫颈癌HeLa细胞生物学行为的影响

发布时间：2018-05-31 14:41

  本文选题：宫颈癌 + c-Fos　； 参考：《重庆医科大学》2014年硕士论文

【摘要】：目的 宫颈癌中常伴有c-Fos过表达，c-Fos过表达与其侵袭能力有关。本研究的主要目的是通过生物信息学工具对c-Fos进行microRNA预测，研究microRNA对其的转录后调控作用，通过过表达候选microRNA检测其对宫颈癌HeLa细胞的增殖、凋亡、迁移等生物学行为的影响。 方法 通过生物信息学工具对c-Fos3'UTR展开进化保守性分析。同时利用生物信息学网站进行microRNA预测，并对预测选定的microRNA所结合的种子序列进行保守性分析。在所有预测的microRNA中选定一个作为研究对象。为探讨选定的microRNA能否直接作用于c-Fos基因mRNA的3'UTR，应用双荧光素酶报告系统对其进行检测。在确认该候选microRNA可转录后调控c-Fos基因后，该microRNA的拟似物mimic被转染入宫颈癌HeLa细胞，检测在蛋白和mRNA水平，该microRNA对于c-Fos的转录后调控作用。流式细胞检测技术被用于检测该microRNA对HeLa细胞的细胞周期以及凋亡的调控作用；EdU染色用于检测过表达备选microRNA对HeLa细胞增殖的影响；此外，划痕实验被用于检测过表达候选microRNA对HeLa细胞迁移能力的影响。 结果 生物学保守性分析显示c-Fos基因的3’UTR在哺乳动物进化中高度保守。利用microRNA在线预测网站对c-Fos基因的靶向microRNA进行了预测。在所有预测的microRNAs中，通过文献查阅、对种子序列的保守性分析筛选后，miR-101被选定进行后续研究。双荧光素酶报告系统分析发现：miR-101可以结合c-Fos3’UTR特定种子序列，并调节上游荧光素酶基因的转录水平。 实时荧光定量PCR结果表明，在转染miR-101mimic后c-Fos的mRNA表达同对照组比较明显降低，Western blot结果显示在转染miR-101mimic后c-Fos蛋白表达与对照组比较明显下降，以上结果表明miR-101能直接作用于c-Fos的3' UTR并在mRNA水平和蛋白水平转录后下调c-Fos的表达。 流式细胞术检测HeLa细胞的细胞周期，结果显示，，相对于阴性对照组和c-Fos过表达恢复组，miR-101实验组对HeLa细胞周期有明显影响，实验组HeLa细胞的G1期相对延长，总S期下降，该结果能表明miR-101能抑制宫颈癌细胞的G1-to-S期转变。 EdU细胞增殖检测以及流式细胞凋亡检测证明过表达miR-101能抑制宫颈癌HeLa细胞的增殖，但对凋亡无明显影响。 细胞迁移划痕实验表明过表达miR-101能有效抑制宫颈癌HeLa细胞的迁移能力。 结论 生物信息学分析表明：c-Fos在哺乳动物进化中高度保守，miR-101所结合的种子序列在哺乳动物进化中高度保守，miR-101能与其结合的种子序列碱基互补配对，故miR-101在理论上有可能转录后调控c-Fos的表达。Luciferase assay结果表明miR-101能与c-Fos的3’非翻译区结合；实时荧光定量PCR结果显示miR-101能在mRNA水平调控c-Fos的表达；Western blot证实了miR-101有效下调c-Fos蛋白的表达；流式细胞周期检测发现miR-101显著降低了宫颈癌HeLa细胞的总S期，抑制了宫颈癌HeLa细胞的G1-to-S期转变；EdU增殖检测显示过表达miR-101能有效遏制宫颈癌HeLa细胞的增殖；同时能抑制宫颈癌HeLa细胞的迁移能力。以上研究结果表明miR-101可作为一种肿瘤抑制microRNA能对宫颈癌细胞的细胞周期、细胞增殖、细胞迁移产生明显影响，从而在宫颈癌中发挥肿瘤抑制的作用。本研究将可能对宫颈癌的治疗提供一条新的思路。
[Abstract]:Purpose

The main aim of this study was to investigate the effect of microRNA on the proliferation , apoptosis and migration of cervical cancer HeLa cells by means of bioinformatics tools .

method

In order to investigate whether the selected microRNA can be directly applied to the 3 ' untranslated region of c - fos gene , a double luciferase reporter system is selected as the research object . After confirming that the selected microRNA can be directly used for regulating the c - fos gene , the proposed microRNA can be transfected into the cervical cancer HeLa cell to detect the post - transcriptional regulation effect of the microRNA on the c - fos . Flow cytometry is used for detecting the cell cycle of the microRNA to HeLa cells and the regulation of apoptosis ;
EdU staining was used to detect the effect of overexpression of alternative microRNA on proliferation of HeLa cells ;
In addition , the scratch test was used to detect the effect of overexpression of candidate microRNA on HeLa cell migration ability .

Results

In all the predicted microRNAs , miR - 101 can bind to the specific seed sequence of c - Fos3 ' , and adjust the transcription level of the upstream luciferase gene .

The results of real - time fluorescence quantitative PCR showed that the expression of c - fos after transfected with miR - 101 was significantly lower than that of the control group , and Western blot showed that the expression of c - fos protein was significantly decreased compared with the control group after transfected with miR - 101 .

The cell cycle of HeLa cells was detected by flow cytometry . The results showed that miR - 101 had a significant effect on the cell cycle of HeLa cells compared with the negative control group and the c - fos overexpression recovery group . The G1 phase of HeLa cells in the experimental group was relatively prolonged and the total S phase decreased , and the results indicated that miR - 101 can inhibit the G1 - to - S phase transition of cervical cancer cells .

EdU cell proliferation assay and flow cytometry demonstrated that miR - 101 inhibited the proliferation of cervical cancer HeLa cells , but had no significant effect on apoptosis .

Cell migration and scratch test indicated that miR - 101 can effectively inhibit the migration ability of cervical cancer HeLa cells .

Conclusion

Bioinformatic analysis shows that c - fos is highly conserved in mammalian evolution , and that miR - 101 is highly conserved in mammalian evolution , and miR - 101 is complementary to the base complement of the seed sequence associated with miR - 101 , so miR - 101 is theoretically possible to regulate the expression of c - fos after transcription . The results of Lucifer assay indicate that miR - 101 can bind to the 3 ' untranslated region of c - fos ;
Real - time fluorescence quantitative PCR results show that miR - 101 can regulate the expression of c - fos at mRNA level ;
Western blot demonstrated that miR - 101 downregulated the expression of c - fos protein .
Flow cytometry showed that miR - 101 significantly reduced the total S phase of cervical cancer HeLa cells and inhibited the G1 - to - S phase transition of cervical cancer HeLa cells .
The proliferation test of EdU shows that miR - 101 can effectively inhibit the proliferation of cervical cancer HeLa cells ;
The results show that miR - 101 can play a role in inhibiting the cell cycle , cell proliferation and cell migration of cervical cancer cells .
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.33

【共引文献】

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本文编号：1960138