调控滋养细胞sFlt-1表达在胎盘血管形成中的作用

发布时间：2018-06-30 10:32

  本文选题：滋养细胞 + 蛋白激酶受体-1　； 参考：《华中科技大学》2016年博士论文

【摘要】：研究目的1.研究PAR-1对绒毛外滋养细胞sFlt-1表达的影响；2.研究氧化应激对滋养细胞sFlt-1表达的影响。研究方法1.PAR-1对滋养细胞sFlt-1表达的调控作用；1.1.人绒毛外滋养细胞传代细胞株HTR-8/Svneo (H8)细胞培养；1.2.PAR-1干扰质粒,过表达质粒分别转染H8细胞,分别设为空白对照组,抑制质粒组,过表达质粒组,在mRNA和蛋白水平检测细胞PAR-1表达；1.3.实时定量PCR (qRT-PCR)检测不同质粒转染后H8细胞sFlt-1, P1GF和VEGF mRNA表达；1.4.酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组细胞中sFlt-1, P1GF和VEGF蛋白表达。2.氧化应激对滋养细胞sFlt-1表达的调控作用2.1.使用二氯化钴(CoCl2)及依达拉奉(eda)处理H8细胞,分别设为空白对照组,缺氧组(CoCl2).治疗组(CoCl2+eda),治疗对照组(eda)4组,MTT实验检测H8细胞活力的变化；2.2.流式细胞术检测H8细胞内活性氧(ROS)的变化水平；2.3. qQT-PCR分别检测各组细胞sFlt-1, P1GF和VEGF mRNA表达；2.4. ELISA分别检测各组细胞sFlt-1, P1GF和VEGF蛋白表达。研究结果1.PAR-1对滋养细胞sFlt-1表达的调控作用1.1.荧光显微镜下可见转染后的H8细胞表现强绿色荧光信号,空白对照组无荧光信号表达,细胞转染效率较好；1.2.同空白对照组相比,过表达质粒组和抑制质粒组PAR-1mRNA表达分别为：570.60±19.2(P0.05)和0.19±0.03(P0.05)；蛋白表达分别为：1.89±0.20(P0.05)和0.63+0.05(P0.05)；1.3.与空白对照组相比,过表达质粒组,抑制质粒组细胞sFlt-1 mRNA水平分别为：2.60±0.26(P0.05)和0.22±0.04(P0.05),蛋白分泌分别为1.49±0.13(P0.05)和0.52±.04(P0.05)：1.4.同空白对照组比较,过表达质粒组,抑制质粒组P1GF mRNA表达分别为：0.61+0.13(P0.05)和2.30±0.18(P0.05),蛋白表达分别为：1.06±0.03(P0.05)和1.11+0.04(P0.05)；1.5.同空白对照组比较,过表达质粒组,抑制质粒组VEGF mRNA表达分别为：1.44±0.24(P0.05)和2.67±0.45(P0.05)；蛋白表达分别为：0.93±0.21(P0.05)和2.08±0.05(P0.05)。2.氧化应激对滋养细胞sFlt-1表达的调控作用2.1.与空白对照组比较,缺氧组细胞活性随药物浓度增大而逐渐下降(P0.05),最适作用浓度为500μM；治疗对照组细胞活力无明显改变(P0.05)；治疗组细胞活力较缺氧组相比,随药物浓度增加而逐渐增加,最佳治疗浓度为100μM(P0.05)；2.2.与空白组比较,缺氧组ROS明显升高(2.41+0.27,P0.05),治疗组和治疗对照组较缺氧组ROS显著降低(1.44±0.11,P0.05)；2.3.与空白组相比,缺氧组sFlt-1mRNA(2.71±0.35,P0.05)和蛋白(3.15±0.12,P0.05)表达均显著增加,同缺氧组相比,治疗组和治疗对照组sFlt-lmRNA(1.22±0.12和1.12±0.17,P0.05)和蛋白(1.33±0.04和1.255±0.05,P0.05)表达均明显降低；2.4.缺氧组,治疗组,治疗对照组P1GF mRNA相对表达水平分别为：2.06±0.47,3.12±0.32，，2.50±0.82(P0.05)；缺氧组同空白组比较,稍增加P1GF蛋白表达(1.32±0.10,P0.05),治疗组同缺氧组相比,P1GF蛋白分泌下降(0.93±0.04,P0.05)：2.5.治疗组能显著促进H8细胞VEGF mRNA表达(5.61±1.05,P0.05),明显高于缺氧组(2.36±0.68,P0.05)；缺氧组,治疗组和治疗对照组VEGF蛋白分泌分别为：0.95±0.07,0.9±0.03,1.02±0.06(P0.05)。结论1.上调PAR-1显著促进HTR-8/SVneo细胞sFlt-1表达,下调PAR-1可抑制细胞sFlt-1产生,表明PAR-1通路能够调控滋养细胞sFlt-1表达。2.氧化应激促进HTR-8/SVneo细胞sFlt-1表达,氧自由基清除可抑制氧化应激诱导的细胞sFlt-1的升高,表明氧化应激对滋养细胞sFlt-1表达具有调控作用。研究目的1.探讨PAR-1调控sFlt-1表达在胎盘血管新生和重铸中的作用2.探讨氧化应激对sFlt-1表达的影响,在胎盘血管新生和重铸中的作用。研究方法1.PAR-1调控sFlt-1表达在胎盘血管新生和重铸中的作用1.1. Hoechast33258染色观察过表达质粒和抑制质粒处理后H8细胞凋亡情况1.2. Western blotting检测各组细胞凋亡相关蛋白BAX和BCL2表达；1.3.细胞迁移实验检测各组细胞迁移能力的变化；1.4.细胞侵袭实验检测各组细胞侵袭能力的变化；1.5. qRT-PCR和ELISA实验分别检测各组细胞侵袭相关蛋白MMP2和TIMP2表达：1.6.管腔形成实验检测PAR-1调控sFlt-1表达对血管形成能力的影响1.7.共培养绒毛组织和蜕膜组织,观察PAR-1调控sFlt-1表达对子宫螺旋动脉重铸过程的影响。2.氧化应激调控sFlt-1表达在胎盘血管新生和重铸中的作用2.1.利用Hoechast33258染色观察CoCl2及eda作用后H8细胞凋亡情况；2.2. Western blotting检测各组细胞凋亡相关蛋白BAX和BCL2表达；2.3. Transwell细胞迁移实验检测各组细胞迁移功能的变化；2.4. Transwell细胞侵袭实验检测各组细胞侵袭能力的改变；2.5. qRT-PCR和ELISA实验分别检测各组细胞侵袭相关蛋白MMP2和TIMP2表达；2.6.小管形成实验检测氧化应激调控sFlt-1表达在血管形成中的作用；2.7.共培养绒毛组织和蜕膜组织,观察氧化应激调控sFlt-1表达对子宫螺旋动脉重铸过程的影响。研究结果1.PAR-1调控sFlt-1表达在胎盘血管新生和重铸中的作用1.1.同空白组相比,过表达质粒组细胞凋亡增强(246.8+15.3%,P0.05),抑制质粒组对细胞凋亡无明显影响(121.4±14.8%,P0.05)；1.2.同空白对照组相比,过表达质粒组明显促进BAX蛋白表达(1.29±08,P0.05),抑制BCL2蛋白表达(0.79±0.05,P0.05)；抑制质粒组明显下调BAX蛋白表达(0.7±0.03,P0.05),上调BCL2蛋白表达(1.21±0.06,P0.05)：1.3.同空白对照组相比,过表达质粒组显著抑制细胞迁移功能(32.7+7.1%,P0.05),抑制质粒组显著促进了细胞迁移(156.9±23.4%,P0.05)。；1.4.同空白对照组相比,过表达质粒组明显抑制细胞侵袭(46.1±4.4%,P0.05)；抑制质粒组显著促进了细胞侵袭能力(121.0±7.5%,P0.05)；1.5.同空白对照组比较,过表达质粒组抑制MMP2 mRNA(0.53±0.08,P0.05)和蛋白(0.78+0.04,P0.05)表达,促进TIMP2(1.61+0.17,1.53±0.05,P0.05表达,抑制质粒组则显著增加MMP2 (1.90±0.17,1.20±0.06, P0.05)表达,降低TIMP2产生(0.35+0.12,0.65±0.04,P0.05)；1.6.同空白对照组相比,过表达组抑制了管腔形成能力(0.38±0.04,P0.05),抑制质粒组促进了小管形成(1.28+0.09,P0.05)：1.7.同空白对照组相比,过表达质粒组螺旋动脉重铸受抑制,动脉重铸减少,抑制质粒组动脉重铸得到改善。2.氧化应激调控sFlt-1表达在胎盘血管新生和重铸中的作用2.1.较空白组相比,缺氧组相对凋亡率为336.1±21.7%,(P0.05),治疗组与缺氧组相比凋亡率降低(175.0±14.4%,P0.05)；治疗对照组与空白组间差异无统计学意义(80.5±22.7%,P0.05)。2.2.同空白对照组比较,缺氧组BAX表达升高(3.47±0.74, P0.05), BCL2表达降低(0.58±0.08,P0.05)：治疗组BAX蛋白表达为(0.88±0.02, P0.05), BCL2蛋白表达为(1.38±0.12,P0.05),治疗对照组BAX和BCL2表达分别为(0.86±0.03和1.07+0.06,P0.05)。2.3.与空白对照组相比,缺氧组相对迁移率为30.0±5.6%,(P0.05),治疗组相对迁移率明显高于缺氧组(100.1±7.5%,P0.05),治疗对照组与空白组间无差异(122.9±7.6%,P0.05)。2.4.与空白对照组相比,缺氧组相对侵袭率为12.8±3.6%,(P0.05),治疗组相对侵袭率明显高于缺氧组(68.9±4.7%,P0.05),治疗对照组与空白组间差异无统计学意义(111.5±17.3%,P0.05)。2.5.同空白对照组比较,缺氧组MMP2 mRNA(0.28±0.05, P0.05)和蛋白(0.73+0.05,P0.05)表达降低,TIMP2蛋白(1.20±04,P0.05)表达升高,治疗组相比缺氧组显著促进MMP2 (1.22±0.23,1.08±0.06, P0.05)表达,抑制TIMP2产生(0.12±±0.04,0.71+0.05,P0.05),治疗对照组MMP2表达为(1.41±0.21,1.12±05),TIMP2表达为(0.41+0.16,0.6±0.07)；2.6.同空白对照组相比,缺氧组官腔形成能力显著下降(0.55±0.10,P0.05),治疗组促进了小管形成,显著高于同缺氧组(0.98±0.08,P0.05),治疗对照组与空白组相比无差异(0.93±0.07,P0.05)；2.7.同空白对照组相比,缺氧组螺旋动脉重铸显著受抑制,治疗组和治疗对照组动脉重铸相对增多。结论1.上调PAR-1诱导HTR-8/SVneo细胞凋亡,抑制滋养细胞迁移、侵袭及血管形成,阻碍子宫螺旋动脉重铸过程,下调PAR-1表达可明显增强细胞生物学功能及管腔样形成能力,改善螺旋动脉重铸障碍,提示PAR-1调控sFlt-1表达在胎盘血管新生和动脉重铸中可能具有正向调节作用；2.氧化应激促进HTR-8/SVneo细胞凋亡,抑制细胞迁移,侵袭和管腔生成,阻碍螺旋动脉重铸,氧自由基清除可明显改善氧化应激诱导细胞生物学功能,管腔形成及动脉重铸障碍,表明氧化应激调控sFlt-1表达在胎盘血管新生和动脉重铸中具有促进作用。研究目的1.通过shPAR-1胎盘局部转染,观察PAR-1体内调控sFlt-1表达对胎盘血管形成的影响；2.探讨体内给予氧自由基清除剂调控sFlt-1表达在改善胎盘血管形成中的作用。研究方法1.PAR-1体内调控sFlt-1表达改善子痫前期大鼠胎盘血管形成1.1.应用一氧化氮合酶抑制剂(L-NAME)建立子痫前期孕鼠模型；1.2.将18只孕鼠随机分为3组,治疗组孕鼠胎盘局部定位注射PAR-1的shPAR-1;1.3.转染后的胎盘行冰冻切片,荧光显微镜下观察荧光表达,qQT-PCR和Western blot定量检测PAR-1表达以验证转染效应；1.4.处死大鼠,收取胎盘,胎鼠,测量其大小,重量并记录；1.5.免疫组化染色(HE和CD34)检测转染后胎盘组织内微血管密度。1.6. qQT-PCR检测转染后胎盘内sFlt-1, P1GF和VEGF表达；1.7.ELISA测定转染后孕鼠血清中sFlt-1, P1GF和VEGF的水平。2.氧自由基清除剂体内调控sFlt-1表达改善子痫前期大鼠胎盘血管形成2.1.通过L-NAME建立子痫前期孕鼠模型；2.2.将20只孕鼠随机分为4组,治疗组孕鼠eda腹腔给药；2.3.处死大鼠,收取胎盘,胎鼠,测量其大小,重量并记录；2.4.免疫组化染色(HE和CD34)检测转染后孕鼠胎盘组织内微血管密度。2.5. qQT-PCR检测胎盘内sFlt-1, P1GF和VEGF表达；2.6. ELISA测定孕鼠血清中sFlt-1, P1GF和VEGF的水平。研究结果1.PAR-1体内调控sFlt-1表达改善子痫前期大鼠胎盘血管形成1.1.实验所用18只孕鼠,麻醉低温死亡一只,余孕鼠存活；转染于妊娠第16天进行,转染3天,于孕20天剖腹取胎鼠和胎盘组织；1.2.荧光显微镜下见胎盘组织内强绿色荧光表达,mRNA和蛋白表达显示治疗组胎盘内PAR-1表达明显受抑制,证实胎盘转染效率；1.3.孕17天前子痫前期和治疗组血管均逐渐升高(P0.05),孕19天治疗组血压显著低于子痫前期组(P0.05)；1.4.同空白对照组相比,子痫前期组胎盘内绒毛间质变窄,胎盘内微血管数目减少(53.33+4.26,P0.05),治疗组较子痫前期组绒毛间质增宽,微血管密度增多(68.67+2.40,P0.05)：1.5.同空白对照组相比,子痫前期组胎盘和胎鼠大小和重量明显降低(P0.05),胎盘肉眼观较其他两组稍发白,同子痫前期组比较,治疗组胎盘、胎鼠得到显著改善(P0.05)：1.6.同空白对照组比较,子痫前期组胎盘sFlt-1表达明显增高(1.87±0.12,P0.05),治疗组胎盘sFlt-1表达较子痫前期组降低(1.01±0.14,P0.05)；子痫前期组较空白对照组相比VEGF(0.44±0.05),PlGF(0.49±0.06)表达均降低(P0.05),治疗组VEGF和PIGF表达增高(1.48±0.21和1.12±0.05,P0.05)。1.7.同空白对照组比较,子痫前期孕鼠血清sFlt-1表达明显升高(2.02±0.03,P0.05),VEGF和PIGF表达(0.73±0.01,0.60±0.04,P0.05)均下降,治疗组相比子痫前期组sFlt-1表达下降(0.64±0.06,P0.05),VEGF表达为(0.96±02,P0.05),PLGF蛋白水平降低(0.77±0.04,P0.05)。2.氧自由基清除剂体内调控sFlt-1表达改善子痫前期大鼠胎盘血管形成2.1.实验所需20只孕鼠,不明疾病死亡一只,余孕鼠存活；于妊娠16天开始,连续给药3天,孕20天后剖腹取胎盘和胎鼠；2.2.孕15天前子痫前期和治疗组血压逐渐升高(P0.05),孕19天治疗组血压较子痫前期组明显下降(P0.05)；2.3.同空白组相比,子痫前期组胎盘内绒毛间质变窄,微血管数减少(54.40±1.25,P0.05),治疗组与子痫前期组相比绒毛间质增宽,胎盘内微血管数目相对增多(73.07±1.31,P0.05),治疗对照组(76.80±3.22)与空白对照组间无统计学差异(P0.05)。2.4.同空白对照组比较,子痫前期组胎盘和胎鼠大小和重量降低(P0.05),治疗组胎盘及胎鼠较子痫前期组有所改善(P0.05),治疗对照组与空白组相比无明显差异(P0.05)；2.5.同空白对照组相比,子痫前期孕鼠胎盘中sFlt-1表达明显增加(1.86±0.14,P0.05),VEGF(0.95±0.12,P0.05)和PIGF(0.72±0.04,P0.05)表达下降,治疗组sFlt-1表达较子痫前期组明显下降(1.12±0.12,P0.05),VEGF(1.79±0.36)和PIGF(0.96±0.01)产生增加(P0.05)：2.6.同空白对照组相比,子痫前期孕鼠血清中sFlt-1明显升高(3.42±0.19,P0.05),VEGF(0.68±0.06)和PIGF(0.50±0.05)表达降低(P0.05),治疗组血清中sFlt-1表达下降(1.37±0.03,P0.05),VEGF(0.84±0.03)和PIGF(0.83±0.04)表达升高(P0.05)。治疗对照组各蛋白表达与空白组无明显差异。结论1.沉默胎盘内PAR-1基因可有效降低sFlt-1的产生,并增强孕鼠胎盘血管生成能力,改善子痫前期孕鼠的不良妊娠结局,表明PAR-1调控sFlt-1表达在胎盘血管形成中具有重要作用,有望成为是治疗胎盘血管形成异常疾病的新的治疗靶点。2.给予氧自由基清除剂可有效抑制胎盘和血清中sFlt-1的产生,改善孕鼠胎盘血管形成能力及不良妊娠结局,表明氧化应激调控sFlt-1表达在改善胎盘血管发育障碍中可能具有重要作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R714

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 万措;有孔胎盘一例报告[J];青海医药杂志;1999年09期

2 李增彦;佘富曼;;胎盘实质内血肿的诊断与处理[J];现代妇产科进展;2007年01期

3 王悦;;妊娠期高血压疾病20例胎盘病理学改变分析[J];中国误诊学杂志;2007年08期

4 侯倩;NK细胞在人类胎盘种植中的作用[J];生殖与避孕;1999年04期

5 孟会;胎盘凋亡的分子机制研究进展[J];国外医学.妇幼保健分册;2002年04期

6 肖建平;王海琦;;妊娠肝内胆汁淤积症胎盘病理研究[J];医学综述;2006年07期

7 陈敏;;妊娠期肝内胆汁淤积症胎盘细胞相关凋亡因子的研究[J];山西医药杂志(下半月刊);2009年01期

8 王雁,尚涛;胎盘肾素-血管紧张素系统与妊娠[J];国外医学.妇产科学分册;2004年02期

9 杨烨;黄中新;杨晓;张娣;;引产分娩胎盘中相关活性物质的表达及其意义[J];中国计划生育学杂志;2007年09期

10 关菊莲;邵兰芳;王丹;崔海峰;;金属基质蛋白酶及其抑制剂在妊娠期肝内胆汁淤积症患者胎盘中表达的研究[J];卫生职业教育;2011年12期

相关会议论文 前2条

1 韩新美;韩健;杨博萍;俞丽丽;周元国;李力;;正常妊娠不同孕期大鼠胎盘中Rho的表达[A];中华医学会第三次全国妊娠期高血压疾病学术研讨会论文汇编[C];2011年

2 韩新美;韩建;杨博萍;俞丽丽;周元国;李力;;正常妊娠不同孕期大鼠胎盘中Rho的表达[A];中华医学会第十次全国妇产科学术会议产科会场（产科学组、妊高症学组）论文汇编[C];2012年

相关重要报纸文章 前1条

1 田地;病毒帮助人类孕育新生命[N];大众科技报;2001年

相关博士学位论文 前8条

1 王芳;整合素连接激酶在胎盘血管性疾病中的作用研究[D];华中科技大学;2012年

2 罗丹;孕激素受体及雌激素受体亚型在妊娠期肝内胆汁淤积症患者胎盘上的表达及意义[D];四川大学;2005年

3 章瑜;辅助生殖技术妊娠安全性临床分析及胎盘蛋白质组学研究[D];浙江大学;2010年

4 张冬鑫;脂氧素A_4在糖皮质激素介导的胎盘炎症敏化中的作用及其机制研究[D];华中科技大学;2014年

5 李益坚;异种胎盘提取物诱导小鼠抗前列腺癌免疫反应实验研究[D];中南大学;2006年

6 王雁;肝细胞生长因子和血管紧张素转化酶与妊高征血管内皮细胞损伤的研究[D];中国医科大学;2004年

7 陈希婧;辅助生殖技术子代胎盘中生长发育相关印记基因CDKN1C、PHLDA2及IGF2的表达和基因印记研究[D];浙江大学;2010年

8 张名均;纳米细菌致胎盘钙化机理的初步探讨[D];重庆医科大学;2014年

相关硕士学位论文 前10条

1 乔宗旭;胎盘中Apelin/Chemerin的表达与妊娠期高血压疾病关系的研究[D];河北医科大学;2015年

2 胡曦文;p110δ在胎盘形成中的表达和功能作用的初步研究[D];广东药学院;2015年

3 渠鸿o

本文编号：2085981