γ-分泌酶抑制剂对铂耐药卵巢癌细胞化疗敏感性影响的研究

发布时间：2018-07-04 09:25

  本文选题：卵巢癌 + 化疗抵抗　； 参考：《河北医科大学》2014年硕士论文

【摘要】：目的：卵巢癌是一种高度恶性的妇科肿瘤，其5年生存率仅有20-30%，死亡率居妇科恶性肿瘤的首位，因其发病隐匿，又被称为“沉默杀手”。目前卵巢癌的治疗方法主要为彻底的肿瘤细胞减灭术和以铂类药物为基础的化疗，然而卵巢癌耐药问题的出现及日益加剧,直接影响卵巢癌患者的治疗效果和预后，也是卵巢癌复发、转移最常见的原因。因此，探讨卵巢癌耐药发生的相关分子机制、如何克服和逆转耐药已成为卵巢癌临床治疗的研究热点，以期提高治疗效果，改善卵巢癌患者预后。 上皮-间质转化（epithelial-mesenchymaltransitions，EMT）是上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。近来研究显示，EMT不仅赋予癌细胞高侵袭、转移能力，而且可赋予癌细胞干细胞样特征，促使癌细胞具有更强的生存能力及耐药性。因此，探索EMT获得过程的精确机制有助于研发靶向治疗药物，与传统化疗药物结合以提高恶性肿瘤治疗效果。 Notch家族信号通路的活性在维持细胞增殖、凋亡及分化的过程中发挥着重要作用。在人类多种恶性肿瘤中（宫颈癌、卵巢癌、结肠癌、胰腺癌等）均有notch基因的异常表达，提示notch信号通路与肿瘤的发生发展密切相关。新近研究表明，肿瘤发生发展过程中notch-1是调节EMT及癌干细胞表型获得的关键因素，而与化疗抵抗关系密切。而γ-分泌酶是激活Notch信号通路的核心环节，，故抑制其在耐药肿瘤中的表达已成为逆转耐药的一种新思路。已有研究显示,γ-分泌酶抑制剂（γ-secretaseinhibitors，GSIs）能够抑制人类多种癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。但目前GSIs对耐药卵巢癌的作用及其机制知之甚少。 本实验通过体外培养上皮性卵巢癌细胞株SKOV3及其耐药细胞株SKOV3/DDP，探讨铂耐药的上皮性卵巢癌细胞中是否存在Notch信号通路异常激活及EMT表型的获得，并初步研究DAPT（GSIs）能否增加卵巢癌铂耐药细胞对顺铂的敏感性及其相关分子机制，这将对改善卵巢癌患者的预后具有重要意义。 方法：将SKOV3和SKOV3/DDP细胞接种于含有10%胎牛血清、青链霉素各l00U/ml的RPMI-1640培养基中，置于37℃，饱和湿度、5%CO2培养箱中培养。取对数生长期细胞用于后续实验，各实验分别重复3次。 1四甲基偶氮唑蓝（MTT）法 取对数生长期SKOV3及SKOV3/DDP细胞，5000个/孔接种于96孔板中，待细胞贴壁后,用不同浓度的DDP（0.0μg/ml、0.625μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5.0μg/ml、10.0μg/ml）作用于两株细胞，使每孔终体积为200μl，培养48h，计算耐药指数；用不同浓度的DAPT（25μmol/L、50μmol/L、75μmol/L）作用于SKOV3/DDP细胞24、48、72h，0.35%DMSO处理的SKOV3/DDP细胞做对照，测定DAPT对SKOV3/DDP细胞的生长抑制作用；按照如下实验分组：①对照组：（0.35%DMSO）②D DP组（2.5μg/ml）③D APT组（50μmol/L）④DDP+DAPT组（2.5μg/ml+50μmol/L），培养24h，测定两药联合作用对SKOV3/DDP细胞增殖情况的影响，并计算金正均值。 2荧光显微镜下观察细胞形态 用不同浓度的DAPT（25μmol/L、50μmol/L、75μmol/L）作用于SKOV3/DDP细胞48h，0.35%DMSO处理的SKOV3和SKOV3/DDP细胞做对照，荧光显微镜下观察细胞形态变化。 3real time-PCR 不同浓度的DAPT（25μmol/L、50μmol/L、75μmol/L）作用于SKOV3/DDP细胞，0.35%DMSO处理的SKOV3和SKOV3/DDP细胞做对照，培养48h后，提取各组细胞总RNA，按照TransGen反转录试剂盒说明合成cDNA,按照CWBIO real time-PCR反应体系进行扩增（ABI7300系统），检测notch-1，E-cadherin及Vimentin mRNA的表达水平。 4流式细胞术 细胞凋亡检测试剂盒按步骤AnnexinV-FITC/PI双染，检测两药联合作用对SKOV3/DDP细胞凋亡的影响。实验分组如下：①对照组：（0.35%DMSO）②D DP组（2.5μg/ml）③D APT组（50μmol/L）④DDP+DAPT组（2.5μg/ml+50μmol/L），培养24h。5应用SPSS 13.0软件进行统计学处理。以上实验均重复3次，数据以均数±标准差（x±s）表示，多组均数的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两样本比较采用t检验。（P0.05）认为有统计学意义。 结果： 1MTT结果显示，相同浓度顺铂作用48小时后，两种细胞抑制率不同，SKOV3细胞的生长抑制率较高，除0.625μg/ml组两种细胞生长抑制率无统计学意义外（P0.05），余各浓度组两种细胞生长抑制率差异均有统计学意义（P0.05），且随着浓度的增加，两组细胞的抑制率差异越明显；顺铂对SKOV3和SKOV3/DDP细胞48h的半数抑制浓度（IC50）分别为2.95μg/ml和14.02μg/ml，SKOV3/DDP细胞的耐药指数为4.75；不同浓度的DAPT作用SKOV3/DDP细胞24h、48h和72h后，以剂量-时间依赖的方式抑制细胞生长,同一时间不同浓度组间差异具有统计学意义（P0.05）,不同时间相同浓度组间差异具有统计学意义（P0.05）；DDP、DAPT组和DDP+DAPT组抑制率分别为（9.13±1.14）、（20.43±0.67）和（36.22±0.99），联合用药组抑制率均高于单一用药组，差异均有统计学意义（P0.05），经金正均法计算，q值为1.311.15，表明在此浓度下，两药合用具有协同效应。 2荧光显微镜下可见，对照组SKOV3细胞表现出上皮细胞样特征，细胞之间连接紧密，呈鹅卵石样排列，SKOV3/DDP细胞则表现出间质细胞样特征，细胞之间连接疏松，排列紊乱，呈长梭型；不同浓度的DAPT作用于SKOV3/DDP细胞48h后，细胞由长梭型逐渐变为短梭型，部分细胞呈卵圆形，具备上皮细胞样特征，75μmol/L DAPT处理组最为明显。 3real time-PCR检测结果显示，DAPT处理SKOV3/DDP细胞前，notch-1及Vimentin mRNA表达水平显著高于SKOV3细胞，E-CadherinmRNA表达水平极低，与SKOV3细胞相比，差异有统计学意义（P0.05）；不同浓度的DAPT作用于SKOV3/DDP细胞48h后，可使E-CadherinmRNA表达水平明显上调，Vimentin mRNA表达水平明显下调，与对照组相比，差异均有统计学意义（P0.05）；且以75μmol/L DAPT处理组最为明显。 4FCM实验结果显示，Control、DDP、DAPT组和DDP+DAPT组凋亡率分别为（7.33±0.59）、（9.93±0.71）、（24.33±1.36）和（50.10±1.92），各处理组凋亡率与对照组相比，差异有统计学意义（P0.05），单一用药组凋亡率均低于联合用药组，差异有统计学意义（P0.05）。 结论： 1DAPT能够抑制SKOV3/DDP细胞的增殖，并呈剂量-时间依赖关系。 2SKOV3细胞在DDP诱导耐药形成SKOV3/DDP细胞过程中发生notch-1信号通路异常激活，并获得EMT样表型，DAPT通过阻断notch-1信号通路,诱导SKOV3/DDP细胞发生间质上皮转化（Mesenchymal-epithelial transition，MET）的形态学和分子表型改变。 3DAPT能增加SKOV3/DDP细胞对顺铂的敏感性。
[Abstract]:Objective : Ovarian cancer is a highly malignant gynecological tumor , the 5 - year survival rate is only 20 - 30 % , the mortality rate is the first in gynecological malignant tumor .

Epithelial - mesenchymal transition ( EMT ) is a biological process in which epithelial cells are transformed into cells with interstitial phenotype through specific procedures . Recent studies have shown that EMT not only confers high invasion and metastasis ability of cancer cells , but also confers a stronger viability and resistance to cancer cells .

The activity of Notch family signaling pathway plays an important role in maintaining cell proliferation , apoptosis and differentiation . It is suggested that notch - 1 is a key factor in the development of human malignant tumors ( cervical cancer , ovarian cancer , colon cancer , pancreatic cancer , etc . ) .

In this study , we investigated whether the presence of Notch signaling pathway abnormal activation and EMT phenotype in epithelial ovarian cancer cells with platinum - resistant ovarian cancer cells were investigated by in vitro culture of ovarian cancer cell line SK3cells and its resistant cell lines . The sensitivity of platinum - resistant cells to cisplatin and its associated molecular mechanism in ovarian cancer cells were investigated .

Methods : The cells were inoculated into RPMI - 1640 medium containing 10 % fetal bovine serum and penicillin - streptomycin l00U / ml . The cells were cultured in 37 鈩

本文编号：2095609