子宫内膜缺血在腹腔子宫内膜异位病灶形成中作用及分子机制研究

发布时间：2018-07-10 20:06

  本文选题：子内膜异位症 + 内膜数量　； 参考：《苏州大学》2014年博士论文

【摘要】：第一部分正常非缺血内膜建立小鼠子宫内膜异位症模型 目的 改良“同种异体腹腔注射正常非缺血子宫内膜”建立小鼠子宫内膜异位症（Endometriosis, EM）模型，研究影响建模的因素，探讨内膜数量及注射频次对内膜腹腔种植的影响。 方法 以8-10周龄的雌性C57BL/6近交系小鼠为模型鼠，对 同种异体腹腔注射内膜法‖进行如下改良：取供体鼠正常子宫内膜均匀切成1×1mm大小，将组织块装入20号针头后进行腹腔注射。研究内容：（1）内膜数量对内膜腹腔种植影响：根据腹腔注射内膜数量，建模鼠随机分为6组（n=10）：1片组,2片组,4片组,8片组,16片组,32片组。（2）根据内膜注射次数对内膜种植影响：以1片内膜作为单次注射量，注射间期为5天，根据注射次数分为5组（n=10）：1次组，2次组，3次组，4次组,5次组。建模后第7天观察病灶，取病灶作HE染色组织学检查。根据肉眼见典型病灶结合组织学检查内膜腺体为存活病灶。以成模率及内膜存活率作为评价内膜存活情况指标。成模率=建模成功鼠（只）/各组总建模鼠；内膜存活率=存活内膜总数（片）/腹腔注射内膜总数（片）。 结果 改良后“腹腔注射内膜法”建立EM模型具有以下优点：改良后内膜残留减少，异位病灶大小均匀，病灶分散，便于观察，成模率、内膜存活率稳定。（1）内膜数量对内膜腹腔种植影响：成模率随着注射内膜量增加而逐渐增加，从1片组20%（2/10）增加到8片组60%（6/10），当内膜数量到达16片以上时成模率达到100%（10/10）; Pearson相关分析内膜数量与成模率成正相关（R=0.982），呈二次函数曲线：Y=1.095+0.863x-0.18x2（R2=0.944，F=33.45，p=0.003）；内膜种植数量与内膜存活率相关（R=0.947），曲线拟合成二次函数曲线：Y=-1.167+3.72x-0.61x2（R2=0.972，F=69.127，p=0.001）。卡方检验8片组内膜存活率显著高于其它各组（p0.05）。 （2）内膜注射次数对内膜腹腔种植的影响：随着内膜注射次数增加，成模率逐渐增加，由1次组20%（2/10）增至5次组100%（10/10），Pearson相关分析内膜注射次数与成模率正相关（R=0.981），回归分析成二次函数曲线：Y=1.095+0.863x-0.18x2（R2=0.944，F=33.45，p=0.003）；内膜存活率与注射次数正相关（R=0.981），曲线拟合成幂函数曲线：Y=1.99X0.949（R2=0.962，F=88.357，p=0.011）。 结论改良后“同种异体腹腔注射非缺血内膜”建立EM模型，病灶分散、病灶大小、数量、成模率、内膜存活率变异小，模型稳定，重复性好。内膜数量及内膜注射频次是影响建模的重要因素。大量内膜（大于16片）单次注射以及少量正常内膜（1片）多次注射成模率高达100%，表明正常非缺血内膜易于在腹膜种植存活。8片单次腹腔注射成模率“60%”，内膜存活率“40%”，病灶数3-5个，适于进行各种干预试验，是理想的EM建模方案。 第二部分缺血内膜腹腔种植探讨 目的 月经期螺旋动脉强烈收缩导致子宫内膜严重缺血达4-48h，少许缺血内膜随经血逆流入盆腹腔，逆流内膜的转归决定了是否发生内异症。但由于伦理学原因，逆流内膜进入腹腔后的动态变化过程及转归目前仍不清楚。本研究以雌性C57BL/6小鼠为试验载体，观察不同程度缺血子宫内膜进入腹腔后的动态变化及最终转归。 方法 结扎供体鼠子宫弓形血管宫体端及卵巢端的方法阻断子宫血流，组织微氧测定仪精确测定子宫组织氧浓度已保证血管结扎可靠性。根据缺血时间（Hour）供体鼠随机分为6组：0h组、0.5h组、1h组、2h组、4h组、8h组。根据“改良腹腔注射内膜法”，采用8片单次注射方案进行建模。对应于供体鼠，180只建模鼠分为6组（n=30）：0h组、0.5h组、1h组、2h组、4h组、8h组。建模后24h每组处死10只，观察内膜早期变化，留取标本。建模后第7天处死剩余小鼠，观察、测量异位病灶，计算各组成模率及内膜存活率。留取建模前供体鼠内膜、建模后24h内膜及异位病灶行HE染色组织学观察，TUNEL染色测定细胞凋亡。 结果 建模前内膜细胞凋亡指数（AI）与缺血时间正相关（R=0.865，p=0.0029;建模后缺血时间与AI呈正相关（R=0.904，p=0.0048）;建模后24h各组AI均较建模前升高（p0.05）。Spearman相关分析成模率与缺血时间呈负相关（R=-0.757，p=0.041）；内膜存活率与缺血时间呈负相关（R=-0.986，p=0.004）。 结论 内膜损伤程度与缺血时间正相关，严重缺血导致细胞坏死或凋亡。缺血内膜进入腹腔后24h，内膜损伤进一步加重，细胞凋亡明显增加。缺血降低内膜在腹腔种植存活，严重缺血（4h）内膜进入腹腔后，细胞因坏死或凋亡而清除，不能在腹膜种植形成异位病灶。 第三部分缺血预处理（IPC）在缺血内膜腹腔种植中作用及机制 目的 组织器官经过非致死性缺血后，能够增强其对随后严重缺血耐受性即缺血预处理(ischemic preconditioning，IPC)。前期研究证实当内膜缺血大于4h时，内膜细胞进入腹腔后因凋亡而清除，不能在腹腔种植存活，这验证了正常妇女月经期逆流内膜的清除机制，但EM妇女逆流内膜能抵抗缺血诱导的细胞凋亡，在腹膜种植存活。推测：内异症妇女子宫异常收缩导致子宫内膜轻度缺血，产生IPC作用，保护内膜缺血性损伤，减少细胞凋亡，促进内膜腹腔种植。本研究以C57BL/6小鼠为试验载体建立小鼠子宫IPC模型，探讨IPC在缺血内膜腹腔种植中作用，IPC对内膜细胞凋亡调节作用以及IPC是否通过Akt信号通路调节细胞凋亡。 方法 共分三部分内容：（1）小鼠子宫IPC模型建立：卡前列素氨丁三醇（欣母沛）可诱导子宫收缩，导致子宫不同程度缺血。采用肌肉注射欣母沛im qd×3d的方法建立小鼠子宫IPC模型。根据欣母沛剂量，供体鼠分为5组：A组为0.125mg/kg体重， B组为0.25mg/kg体重，C组为0.5mg/kg体重，D组为1.0mg/kg体重。对照组E组肌注0.1ml注射用水。组织微氧仪动态测定子宫组织氧浓度变化，测定各组子宫最低氧浓度，缺氧（氧浓度100μ mol/l）持续时间。建模鼠对应分为A、B、C、D、E共5组，每组20只。建模后第7天观察病灶情况，计算各组成模率及内膜存活率。 （2）IPC在缺血内膜腹腔种植中作用：根据上述试验，供体鼠以欣母沛0.5mg/kg体重，im, qd×3d作为IPC方案。第4天结扎子宫血管建立子宫内膜缺血模型（Ischemia,ISCH）。供体鼠根据IPC及缺血时间分为6组（n=30只）：IPC组，ISCH2h（缺血2h），ISCH4h组（缺血4h），IPC+ISCH2h组， IPC+ISCH4h组，CON组（对照组）。采用改良腹腔内膜注射法建立EM模型。受体鼠对应分为IPC组，ISCH2h组，ISCH4h组，IPC+ISCH2h组， IPC+ISCH4h组，CON组。取建模前及建模后24h内膜，行组织切片TUNEL染色检测细胞凋亡变化。建模后第7天观察病灶，计算各组建模率及内膜存活率。 （3）IPC保护作用的分子机制本部分选择欣母沛0.5mg/kg体重，im, qd×3d作为IPC方案，结扎子宫血管2h作为子宫内膜ISCH模型。Akt特异性阻断剂LY294002（LY）进行阻断试验，于注射欣母沛前15min，静脉注射LY294002，剂量为10μmol/kg。根据IPC、ISCH及LY，，32只鼠随机分为4组（n=8只）：CON组、ISCH组、IPC+ISCH组、LY+IPC+ISCH组。子宫缺血2h取内膜组织行TUNEL染色测细胞凋亡指数，WEST检测磷酸化Akt(p-Akt)及其下游底物磷酸化水平（p-Bad、p-GSK-3β、p-mTOR、p-4EBP1、p-S6），以及活化caspase-3。 结果 （1）小鼠子宫IPC模型建立：Pearson相关分析发现最低氧浓度与欣母沛剂量呈负相关(p=0.049，R=-0.88)，缺氧持续时间与欣母沛剂量完全相关(p=0.000，R=1.0)。卡方检验C组成模率及内膜存活率高于A、B、D组及对照组（P0.05）。 （2）IPC在缺血内膜腹腔种植中作用： 结果显示IPC+ISCH2h组成模率及内膜存活率高于ISCH2h组（p=0.028，p=0.000）；IPC+ISCH4h组成模率及内膜存活率高于ISCH4h组（p=0.035，p=0.024）。IPC+ISCH2h组AI低于ISCH2h组（p0.05），IPC+ISCH4h组AI低于ISCH4h组（p0.05）。 （3）IPC保护作用的分子机制 结果显示IPC+ISCH组AI低于ISCH组及IPC+ISCH+LY组（p0.05），ISCH组与IPC+ISCH+LY组AI无差别（p0.05）。IPC+ISCH组p-Akt、p-Bad、p-GSK-3β、p-mTOR、p-4EBP1、p-S6高于CON组及ISCH组（p0.05）；ISCH组p-Akt、p-GSK-3β、p-mTOR、p-4EBP1、p-S6与LY+IPC+ISCH组相比无差别（p0.05）；IPC+ISCH组活化Caspase-3水平低于ISCH组及LY+IPC+ISCH（p0.05），LY+IPC+ISCH组与ISCH组无差别（p0.05）。 结论 欣母沛能有效诱导子宫收缩而缺血建立小鼠子宫IPC模型；IPC促进正常非缺血内膜腹腔种植；IPC减少缺血内膜细胞凋亡，促进缺血内膜腹腔种植存活；IPC通过激活Akt信号通路，磷酸化其下游底物Bad、GSK-3β，抑制凋亡执行分子Caspase-3活性，最终抑制缺血内膜细胞凋亡；通过磷酸化mTOR及其下游底物4EBP1、S6，促进缺血内膜细胞的生存。
[Abstract]:Establishment of model of endometriosis in the first part of normal non - ischemic intima

Purpose

To improve the model of endometriosis ( EM ) in mice with normal non - ischemic endometrium , the factors influencing the modeling were studied , and the influence of the number of intima and the frequency of injection on the endometrial cavity was studied .

method

浠

本文编号：2114536